Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für anaerobe Proteinreinigung, anaerobe Proteinkonzentration und anschließende kinetischen Charakterisierung mittels einer Sauerstoff-Elektrode-System. Die Methode wird anhand des Enzyms DesB, ein Dioxygenase Enzym, das ist stabiler und aktiv, wenn gereinigt und in einer anaeroben Umgebung gespeichert.
Abstract
Sauerstoffempfindlichen Proteine, einschließlich jene Enzyme, die Sauerstoff als Substrat, nutzen können Stabilität wenn gereinigt mit traditionellen aerobic Reinigungsverfahren reduziert haben. Diese Handschrift zeigt die technischen Details der anaeroben Reinigungsprozess, einschließlich der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien, die Methoden für die Säulenchromatographie in einem Handschuhfach und die Entsalzung des Proteins vor Kinetik beteiligt. Ebenfalls beschrieben sind die Methoden für die Erstellung und Verwendung einer Sauerstoffelektrode zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms, Verwendung von Sauerstoff. Diese Methoden werden anhand der Dioxygenase Enzym DesB, ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6.
Introduction
Enzyme, die Eisen oder anderen Metallen Sauerstoff aktivieren nutzen sind oft anfällig für Inaktivierung während des Reinigungsprozesses aufgrund ihrer Entfernung von den reduzierenden Umgebung einer Zelle. Daher diese Proteine als Zelle Lysates verwendet werden müssen, externe Reduktionsmittel ausgesetzt werden oder anaerob gereinigt werden, um sicherzustellen, dass sie optimale enzymatische Aktivität1,2,3,4. Für diese Enzyme, die sind ist sauerstoffempfindlichen (speziell Eisen-haltige Enzyme), all den Schritten Aufreinigung und Charakterisierung unter Beibehaltung der anaerobe Bedingungen notwendig, sie vollständig zu charakterisieren. Dies hat dazu geführt, Forscher, gesamte Labor Aufbauten innerhalb der Grenzen des anaeroben Kammern für Studien von Protein-Expression durch Kristallographie5,6,7,8 bis hin zu entwickeln .
Hier berichten wir über Methoden zur anaeroben Reinigung und kinetischen Charakterisierung des Enzyms DesB mit einem Sauerstoff-Elektrode-System. DesB ist ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6, die mit LigAB, eine Protocatecuate-Dioxygenase aus dem gleichen Organismus zusammenhängt. Beide Enzyme gehören zu den Typ II Protocatechuate Dioxygenase (PCAD)-Superfamilie, die bis Datum9, wahrscheinlich teilweise durch Enzyme dieser Superfamilie wird anfällig für Inaktivierung wenn gereinigt, mit Standard-aerobic nicht umfassend untersucht worden Protein-Reinigungsverfahren. Da einige der PCAD Enzyme Substrat Promiskuität angezeigt, während andere Substrat-spezifische2,10, muss weitere Charakterisierung dieser Superfamilie Spezifität Determinanten identifizieren. Wie in mehreren Enzym Superfamilies11,12,13,14,15festgestellt wurde, können kleine Moleküle Aktivität über direkte wettbewerbsfähig Hemmung oder die Bindung von ändern Moleküle zu trennen allosterische Taschen, wodurch eine Zunahme oder Abnahme der Enzymaktivität16. Während Kinetik allein die bindende Lage ein Modulator unterscheiden kann, ist das Bestimmen der Größe der Änderung einer Aktivität wichtig für das Verständnis der Auswirkungen. Als solcher, Methoden zur kinetischen Charakterisierung von native DesB Tätigkeit und seine Tätigkeit in Gegenwart von 4-Nitrocatechol (4NC), eine Substanz, die häufig verwendet, um zu charakterisieren und hemmen Dioxygenase Enzyme2,17, 18, werden angezeigt.
DesB ist in der Lage zu brechen in welcher Ring Eröffnung katalysiert wird mit Sauerstoff als einem der Substrate10,19Gallat, eine Lignin-abgeleitete aromatische Verbindung, über eine Extradiol-Dioxygenase (EDO)-Reaktion. Diese enzymatische Reaktion tritt im Rahmen der den Abbau von Lignin, einem aromatischen Heteropolymer gefunden in der Zellwand von Pflanzen. Lignin depolymerisiert werden kann, einer Vielzahl von aromatischen Verbindungen, die nachgeben kann weiter unterteilt werden in zentralen Metaboliten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol Dioxygenases (EDO) katalysieren einen Ring Eröffnung Reaktion auf Dihydroxylated aromatischen Verbindungen, wo Spaltung angrenzend an ein Metall koordiniert Diol auftritt; im Gegensatz dazu Spalten Intradiol Dioxygenases analoge aromatische Verbindungen zwischen den beiden Hydroxylgruppen (Abbildung 1). EDOs, wie viele andere mechanistische haben eine zweiwertige Metallzentrum für koordinierende Fe(II), bestehend aus einem zwei-Histidin, eins-carboxylat Triade9,34,35. Diese mechanistische werden entweder durch Autoxidation oder Mechanismen basierenden Inaktivierung, oxidiert, während das Enzym inaktiv2,36,37,38gerendert wird.
In der experimentellen Verfahren, die in dieser Handschrift beschrieben nutzen wir DesB, ein Mitglied der PCAD-Superfamilie aus dem Bakterium Sphingobium SP. SYK-6, um die Zufuhr von Sauerstoff über die C4-C5-Anleihe der Gallat (Abbildung 2A) katalysieren. Die Regiochemistry der dieser Spaltung ist analog zum LigAB, ein Protocatechuate-4,5-Dioxygenase (Abb. 2 b). Bisher gehören Untersuchungen zu diesem Gallat Dioxygenase keine Berichte von Verbindungen, die DesB10,19,39hemmen. Mit dem Einsatz von aeroben Reinigungsverfahren ausgestellt DesB schwankende Aktivität, während wir mit dem Einsatz von anaeroben Methoden konsequent Protein mit reproduzierbaren Aktivität erhalten konnten. Die kinetischen Untersuchungen beschrieben hier zeigen die Methoden für die anaerobe Reinigung von DesB, kinetischen Charakterisierung von der Reaktion des DesB mit Gallat und die Hemmung der DesB von 4-Nitrocatechol (4NC).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die entscheidenden Schritte bei der Beschaffung von aktiven, gereinigten DesB Protein beinhalten die Bildung und Aufrechterhaltung der reduzierten Fe(II) aktiven Seite im Enzym. Als solche korrigieren Leistung von Induktion, Reinigung, Konzentration und Entsalzung Schritte sind unerlässlich, um aktives Enzym erfolgreich zu erhalten. Induktion der Proteinexpression in Anwesenheit von Eisen Ammoniumsulfat 1 mM sorgt dafür, dass Fe(II) aktiven Seite des DesB korrekt eingebaut ist. Diese Methode orientiert sich an Studien …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Camille Keller der Wesleyan University für technische Unterstützung zu danken. Besonderer Dank geht an Professor Lindsay D. Eltis sowie Jenna K. Capyk von der University of British Columbia und Christian Whitman von der University of Texas at Austin, für ihre Beratung über anaerobe Protein Reinigungsverfahren und die Verwendung von einem O2 -empfindliche Elektrode.
Materials
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
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