大脑中动脉腔内丝闭塞是啮齿类动物实验性脑卒中体内最常用的模型。另一种手术方法, 允许颈动脉修复在这里进行, 这使得颈总动脉再灌注和充分再灌注到大脑中动脉区域。
缺血性中风是全世界成人长期残疾和死亡的主要原因。目前可用的治疗方法是有限的, 只有组织纤溶酶原激活剂 (tpa) 作为一种经批准的药物治疗, 以针对缺血性中风。目前缺血性脑卒中领域的研究主要集中在更好地了解脑卒中的病理生理学, 开发和研究新型药物靶点。可靠的实验中风模型是潜在治疗进展的关键。大脑中动脉闭塞模型 (mcao) 是相关的临床和最常用的手术模型缺血性脑卒中的啮齿类动物。然而, 这种模型的结果, 如病变体积, 与高度的变异性, 特别是在小鼠。这里描述的替代 mcao 模型允许颈总动脉 (cca) 再灌注和增加大脑中动脉 (mca) 区域的灌注, 使用带有纤维基因密封胶的组织垫修复血管, 并进行改进通过避免颈外动脉结扎 (eca) 小鼠的福利。这减少了对威利斯圆环的依赖, 这是众所周知的高度解剖变化的小鼠。代表性数据表明, 使用这种替代手术方法可以减少传统 mcao 方法与此处描述的替代方法之间的病变体积的变异性。
脑卒中的一个主要原因是大脑中动脉区域的局灶性缺血。组织纤溶酶原激活剂 (tpa) 是唯一的药物治疗, 已被证明有效, 尽管许多临床药物试验针对缺血性中风1,2。然而, 出于安全考虑和狭窄的治疗窗口 (< 4.5 h), 只有 ~ 15% 的中风患者有资格获得 tpa, 再合成率可以 < 50% 3,4。
可重复和临床相关的中风动物模型被认为是至关重要的发展新的和潜在的中风治疗。然而, 由于担心动物模型结果的一致性和可变性, 完善现有的体内模型以改进从临床前研究到临床的翻译仍然很重要。从潜在治疗的临床前实验疗效到临床应用缺乏转化, 是脑卒中研究持续关注的问题.翻译失败的原因可能是多方面的, 可能与试验设计、治疗延迟、临床中风异质性以及所使用的动物模型的局限性有关。中风研究的一个关键挑战仍然是发展安全和有效的治疗方法。
腔内长丝置入大脑中动脉闭塞 (mcao) 是实验性脑卒中最常用的椎体模型。这个模型允许在缺血诱导后恢复血液流动, 模仿人类中风7中发生的事件.然而, 特别是在小鼠中, 尽管采用了定义的手术方案 8,9, 10,但也会出现不同标准偏差的异质性病变量。它是典型的看到小纹状体和大纹状皮质病变体积11的双模分布。为了诱发缺血, 灯丝通常是通过 cca 或 eca 的切口插入的, 然后保持永久结扎12。cca 的永久结扎阻止血液流入颈内动脉 (ica), 随后又阻止 mca 区域。这导致再灌注依赖于威利斯圆环 (cow) 内的附带供应。cow 结构具有个别动物之间的解剖变异性, 特别是在 c57bl6 mice-a 菌株通常用于体内冲程研究13。另一种方法, 即通过非洲经委会插入长丝, 确实允许通过共同评估继续灌注, 但这种方法损害了对非洲经委会领土的动脉供应, 而老鼠已经证明, 动脉供应对动物的幸福性 14。
在建立的 mcao 模型中, 依赖 cow 进行侧支供应和再灌注, 在一定程度上可以解释闭塞后病变体积的变异性。我们描述了另一种小鼠外科手术, 避免了 eca 结扎和 cca 切口修复, 从而允许通过 cca 再灌注, 独立于 cow。此前, 大鼠对 cca 切口的修复已被证明能通过 cca15成功地进行再灌注。我们已经成功地将这种方法应用于小鼠 11只, 并在这里报告的方案, 导致减少病变体积的变异性, 主要的结果措施用于实验中风研究。
在本协议中, 我们演示了如何通过 cca 血管长丝插入进行 mcao, 然后进行 cca 血管修复, 其中包括组织垫和密封胶的应用, 以允许再灌注。
在啮齿类动物中 , 小导瞬态 mcao 是最常用的实验中风模型 , 因为它允许再灌注到受影响的区域 , 模仿临床缺血性中风后事件的发生 7 。本文报道了一种替代的手术方法, 以传统的方法文件诱导的瞬态 mcao 小鼠。另一种方法, 包括镇痛治疗、eca 结扎避免和 cca 切口修复, 在使用 mri 和组织学染色方法11进行评估时, 可降低 lv 变异性。
传统的诱导 mcao 的方法在很大程度上依赖于 eca 的横截面, 或至少是结扎, 这已经在大鼠身上被证明会影响饮酒行为和 mcao14之后体重下降的增加。这里定义的协议, 在小鼠中, 避免了 eca 结扎和镇痛的增加, 建议在 mcao 之后减少体重下降, 对病变体积没有影响。在大多数实验中风研究中, 由于可能对实验结果产生混淆影响, 避免使用镇痛, 或至少不报告。然而, 完全避免镇痛并不总是有道理的, 有必要在动物的福利需求与实现科学目标之间取得平衡。
动物大小、应变和脑血管解剖的差异, 除了长丝大小和类型变化外, 都被认为会影响中风结果23,24。这里描述的替代方法避免了再灌注过程中对 cow 的依赖, 从而至少在一定程度上减少了动物之间在病变体积中的变异性。cow 解剖在小鼠中变化很大, 特别是在 C57BL/菌株中, 这在实验中风研究中经常使用。90% 的 c57bl”小鼠由于不同的后交通动脉 (pcoma) 通畅而具有不完全的 cow, 这可能会对 mca 区13以外结构的灌注不足而导致缺血损伤的体积产生影响,25. 如下所示, 修复小鼠的 cca, 导致通过cca 重建到缺血区的血液流动, 如前15只大鼠所述。这里的代表性数据显示, cca 的修复增加了再灌注, 尽管 cca 中的血液流动没有直接测量。然而, 外科医生有可能在血管修复后用血液想象 cca 再灌注, 因为它在修复部位的躯干、近端和远端都恢复到脉动和完全状态。这种视觉确认, 以及缺血区的激光多普勒血流读数, 可以用来确认成功修复血管。组织垫应用与从 cca 中取出血管夹之间的时间会对 cca 的通畅性产生影响, 因为减少组织垫应用与夹子去除之间的时间将阻止组织垫粘附在共同国家评估的对立面。虽然技术上具有挑战性, 但此处解释的替代 mcao 程序不需要任何额外的技能, 而不是在小鼠身上进行 mcao 手术诱导所需的技能。
传统上与结果测量的高变异性相关, 实验性中风研究可能有动力不足的倾向。道德和福利要求加上经济和实际问题可能会导致研究动力不足。通过减少结果的可变性, 从而在实验组中产生更一致的病变结果, 可以进行更有效的功率计算, 最终目的是为研究提供适当的动力。
总之, 这种替代的 cca 修复程序, 在小鼠身上, 导致实验中风后病变体积的变异性较小, 并使较小的实验组能够在适当的功率计算时测试治疗效果使用。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由国家研究中动物更换、提炼和减少中心 (NC3Rs) 资助;nc·m00011–至 cg)。提交人感谢莱斯特大学生物医学服务司的工作人员对实验动物的照顾, 并感谢玛丽亚·维斯卡杜拉基的统计建议。代表性结果在允许的情况下适应从疾病模型& 机制 11。
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |