Obstrucción de filamento intraluminal de la arteria cerebral media es el modelo más frecuentemente utilizado en vivo del movimiento experimental en roedores. Una alternativa quirúrgica para permitir la reparación de la arteria carótida común se realiza aquí, lo que permite la reperfusión de la arteria carótida común y una reperfusión completa para el territorio de la arteria cerebral media.
El ictus isquémico es una causa importante de discapacidad a largo plazo de adultos y la muerte en todo el mundo. Los tratamientos actuales disponibles son limitados, con sólo activador del plasminógeno tisular (tPA) como un tratamiento farmacológico aprobado a accidentes cerebrovasculares isquémicos. La investigación actual en el campo del ictus isquémico se centra en la mejor comprensión de la patofisiología del accidente cerebrovascular, para desarrollar e investigar nuevas dianas farmacéuticas. Modelos de movimiento experimental confiable son cruciales para la progresión de tratamientos potenciales. El modelo de arteria cerebral media oclusión (MCAO) es clínicamente relevante y lo más frecuentemente usado modelo quirúrgico de ictus isquémico en los roedores. Sin embargo, los resultados de este modelo, tales como volumen de la lesión, están asociados con altos niveles de variabilidad, especialmente en ratones. El modelo alternativo de MCAO se describe aquí permite la reperfusión de la arteria carótida común (CCA) y la mayor perfusión del territorio arteria cerebral media (MCA), usar una almohadilla de tejido con sellador a base de fibrinógeno para reparar el buque y la mejor bienestar de los ratones al evitar la ligadura de la arteria carótida externa (CEPA). Esto reduce la dependencia del círculo de Willis, que se sabe para ser altamente anatómico variable en ratones. Datos representativos demuestran que utilizando esta alternativa quirúrgica disminuye la variabilidad en el volumen de la lesión entre el enfoque tradicional de MCAO y el enfoque alternativo descrito aquí.
Una de las principales causas de infarto cerebral son la isquemia focal en el territorio de la arteria cerebral media. Activador del plasminógeno tisular (tPA) es el tratamiento sólo farmacológico con eficacia demostrada, a pesar de numerosos ensayos clínicos de drogas dirigido a ictus isquémico1,2. Sin embargo, debido a preocupaciones de seguridad y una estrecha ventana terapéutica (< 4.5 h), sólo el ~ 15% de los pacientes con accidente cerebrovascular son elegible para recibir tPA, y las tasas de recanalización pueden ser < 50%3,4.
Reproducibles y clínicamente relevantes los modelos animales de accidente cerebrovascular se consideran esenciales para informar el desarrollo de tratamientos terapéuticos de tiempos nuevos y potenciales. Sin embargo, debido a las preocupaciones en cuanto a consistencia y variabilidad en los resultados con modelos animales, sigue siendo importante refinar en vivo los modelos existentes para mejorar la traducción de preclínica a la clínica. La falta de traducción de la eficacia preclínica experimental de tratamientos potenciales para uso clínico es una preocupación constante para el movimiento de investigación5. Razones de falta de traducción suelen ser múltiples y pueden estar relacionadas con, por ejemplo, el diseño del ensayo, tratamiento retrasos, heterogeneidad del movimiento clínico, y las limitaciones de los modelos animales utilizan6. Un desafío clave para la investigación del movimiento sigue siendo el desarrollo de tratamientos seguros y eficaces.
Oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) por la inserción del filamento de intramural es el modelo roedor más frecuentemente usado en vivo del movimiento experimental. Este modelo permite la restauración del flujo sanguíneo después de una inducción de isquemia, imitando los sucesos que ocurren en el movimiento humano7. Sin embargo, en particular en los ratones, volúmenes de lesión heterogénea con diferentes desviaciones estándar se producen aunque protocolos quirúrgicos son aplicadas8,9,10. Es típico ver una distribución bimodal de estriado pequeño y grande la lesión cortical striato volúmenes11. Para inducir isquemia, el filamento generalmente se inserta a través de una incisión de la CCA o cepa que luego permanecen permanentemente ligados12. La ligadura permanente de la CCA evita el restablecimiento del flujo sanguíneo en la arteria carótida interna (ACI) y, posteriormente, el territorio del MCA. Esto hace que la reperfusión que dependen de la fuente colateral dentro de círculo de Willis (vaca). La estructura de la vaca tiene variabilidad anatómica entre animales individuales, particularmente en C57BL/6 ratones una cepa típicamente usadas en vivo tiempos investigación13. Un método alternativo de inserción del filamento a través de la ECA, permitir la perfusión continua a través de la CCA, pero compromisos de este método la fuente arterial en el territorio de la cepa, que se ha demostrado, en ratas, a tener un efecto perjudicial sobre el animal bienestar,14.
La dependencia de la vaca para fuente colateral y reperfusión en el modelo establecido de MCAO puede, en parte, explicar la variabilidad del volumen de lesión después de la oclusión. Describimos un procedimiento quirúrgico murino alternativo donde se evita la ligadura de la cepa y la incisión de la CCA se repara, lo que permite reperfusión a través de la CCA, independiente de la vaca. La reparación de la incisión de la CCA ha demostrado previamente en ratas como resultado una reperfusión exitosa a través de la CCA15. Han aplicado este enfoque con éxito en ratones11 y presenta aquí el protocolo que se traduce en una menor variabilidad en el volumen de la lesión, la principal medida de resultado usada en estudios experimentales de la carrera.
En este protocolo, demostramos cómo MCAO se comprometen a través de la inserción de filamento CCA recipiente seguido de CCA buque reparación, que consiste en una aplicación de almohadilla y sellador de tejido para permitir la reperfusión.
Inducción de filamento de MCAO transitorio en roedores es el más frecuentemente usado modelo experimental de movimiento, ya que permite reperfusión en el área afectada, mímico la ocurrencia de eventos de accidente cerebrovascular isquémico clínico7. Aquí es una alternativa quirúrgica para el método tradicional de MCAO transitorio filamento-inducida en ratones. El enfoque alternativo, con tratamiento de analgesia, cepa ligadura evitación y reparación de la incisión del CCA, se traduce en una variabilidad reducida de LV cuando se evaluó mediante resonancia magnética y de métodos tinción histológica11.
Los enfoques tradicionales para inducir MCAO en gran medida se basan en el corte transversal, o en la ligadura por lo menos, de la cepa, que se ha demostrado, en ratas, que afectan el comportamiento de beber y un aumento en la pérdida de peso después de la MCAO14. El protocolo definido aquí, en ratones, con la evitación de la ligadura de la cepa y además analgesia, sugirió una reducción en la pérdida de peso después de MCAO con ningún efecto sobre el volumen de la lesión. El uso de la analgesia es evitar, o al menos no registrado, en la mayoría de los estudios experimentales de la carrera, debido a posibles efectos de confusión sobre los resultados experimentales. Sin embargo, evitando completamente la analgesia no siempre está justificado y es necesario para equilibrar las necesidades de bienestar de los animales con el logro de los objetivos científicos.
Diferencias en el tamaño del animal, cepa y anatomía cerebrovascular, además de variaciones de tamaño y el tipo de filamento, se proponen influir en tiempos resultados23,24. El enfoque alternativo descrito aquí evita la dependencia de la vaca durante la reperfusión, reduciendo así, al menos en parte, la variabilidad entre animales en el volumen de la lesión. Anatomía de la vaca es muy variable en los ratones, en particular en la C57BL /6 cepa, que a menudo se utiliza en estudios experimentales de la carrera. 90% de ratones C57BL/6 tienen una vaca incompleta debido a una variada posterior comunicación arteria (PcomA) la permeabilidad, que puede tener un efecto sobre el volumen de daño isquémico debido a la insuficiente perfusión de estructuras fuera del territorio MCA13, 25. reparación de la CCA en los ratones, como se muestra aquí, se traduce en el restablecimiento de la sangre flujo a través de la CCA en el área isquémico, como se ha descrito en ratas15. Los datos representativos aquí muestran que la reparación de la CCA aumenta la reperfusión, aunque el flujo de sangre en el CCA no se midió directamente. Sin embargo, es posible que el cirujano pueda visualizar la reperfuse CCA con sangre después de la reparación del buque, como vuelve a un estado completo y pulsante a lo largo del tronco, proximal y distal a la localización de la reparación. Esta confirmación visual, junto con las lecturas de flujometría Doppler láser de la zona isquémica, puede utilizarse para confirmar la reparación exitosa de la nave. El tiempo entre la aplicación de la almohadilla de tejido y la eliminación del gancho del buque de la CCA puede tener un impacto sobre la permeabilidad resultante de la CCA, como reducir el tiempo entre la aplicación de la almohadilla de tejido y la eliminación de clip evitará la almohadilla de tejido adherido o frente lado del CCA. Aunque técnicamente difícil, el procedimiento alternativo de MCAO explicado aquí no requiere de ninguna habilidad adicional que los requeridos para llevar a cabo la inducción quirúrgica de MCAO en ratones.
Tradicionalmente asociados con una alta variabilidad en las medidas de resultado, los estudios experimentales de la carrera tenga una tendencia a ser underpowered. Requisitos éticos y de bienestar en combinación con las preocupaciones económicas y práctica pueden contribuir a estudios siendo underpowered. Reduciendo la variabilidad en el resultado y, por lo tanto, producir resultados de lesión más consistentes a través de un grupo experimental, se pueden realizar cálculos de energía más eficaces con el objetivo de los estudios adecuadamente alimentada.
En conclusión, este procedimiento de reparación alternativo del CCA, en ratones, produce menos variabilidad en el volumen de la lesión siguiendo el trazo experimental y cálculos de energía más pequeños grupos experimentales permite que se requerirán para las pruebas de un efecto del tratamiento cuando corresponda se utilizan.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el centro nacional para el reemplazo, el refinamiento y la reducción de animales en investigación (NC3Rs; NC/M000117/1 a CG). Los autores agradecen al personal de la división de servicios biomédicos de la Universidad de Leicester, por su cuidado de los animales de experimentación y Maria Viskaduraki por su asesoría estadística. Resultados representativos están adaptados con autorización de modelos de la enfermedad y mecanismos de11.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |