L’occlusione di filamento intraluminal dell’arteria cerebrale centrale è il modello più utilizzato in vivo di colpo sperimentale nei roditori. Approccio chirurgico alternativo per consentire la riparazione dell’arteria carotica comune avviene qui, che permette la riperfusione dell’arteria carotica comune e un completo riperfusione nel territorio dell’arteria cerebrale media.
L’ictus ischemico è delle principali cause di disabilità a lungo termine adulto e morte in tutto il mondo. I trattamenti correnti disponibili sono limitati, con solo attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) come trattamento farmaco approvato per indirizzare i colpi ischemici. La ricerca attuale nel campo del colpo ischemico si concentra sulla migliore comprensione della patofisiologia del colpo, per sviluppare e studiare nuovi target per la farmaceutica. Modelli di colpo sperimentale affidabile sono cruciali per la progressione di potenziali trattamenti. Il modello di occlusione (MCAO) dell’arteria cerebrale centrale è clinicamente rilevante e il più delle volte usato modello chirurgico del colpo ischemico in roditori. Tuttavia, i risultati di questo modello, come il volume della lesione, sono associati con alti livelli di variabilità, in particolare nei topi. Il modello MCAO alternativo descritto qui permette la riperfusione dell’arteria carotica comune (CCA) e l’aspersione aumentata del territorio dell’arteria cerebrale centrale (MCA), utilizzando un pad di tessuto con sigillante a base di fibrinogeno per riparare la nave ed il miglioramento della benessere dei topi evitando la legatura dell’arteria carotica esterna (ECA). Questo riduce la dipendenza del cerchio di Willis, che è noto per essere altamente anatomicamente variabile nei topi. Dati rappresentativi indicano che usando questo metodo chirurgico alternativo fa diminuire la variabilità in volumi di lesione tra l’approccio MCAO tradizionale e l’approccio alternativo descritto qui.
Delle principali cause di ictus cerebrale è ischemia focale nel territorio dell’arteria cerebrale centrale. Attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) è il trattamento farmacologico solo disponibile con efficacia provata, nonostante numerosi esperimenti clinici mirati a colpo ischemico1,2. Tuttavia, a causa di problemi di sicurezza e una ristretta finestra terapeutica (< 4,5 h), solo ~ 15% di tutti i pazienti colpiti da ictus sono idonei a ricevere tPA e i tassi di ricanalizzazione possono essere < 50%3,4.
Riproducibile e clinicamente rilevanti modelli animali del colpo sono considerati essenziali per informare lo sviluppo di trattamenti terapeutici di tempi nuovi e potenziali. Tuttavia, a causa di preoccupazioni per quanto riguarda la coerenza e la variabilità nei risultati con modelli animali, rimane importante affinare i modelli esistenti in vivo per migliorare la traduzione da studi preclinici per la clinica. La mancanza di traduzione dall’efficacia sperimentale preclinica di potenziali trattamenti per uso clinico è una preoccupazione costante per corsa ricerca5. Ragioni del fallimento della traduzione sono probabili essere più e possono essere correlati, ad esempio, la progettazione dello studio, ritardi di trattamento, eterogeneità clinica dell’ictus, e le limitazioni dei modelli animali utilizzati6. Una sfida chiave per la ricerca sull’ictus rimane lo sviluppo di trattamenti sicuri ed efficaci.
Occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAO) tramite l’inserzione di filamento intraluminal è il modello del roditore utilizzate più di frequente in vivo di colpo sperimentale. Questo modello permette il ripristino del flusso sanguigno dopo un’induzione di ischemia, che imita gli eventi che si verificano nel tratto umano7. Tuttavia, in particolare nei topi, volumi di lesione eterogenea con varie deviazioni standard si verificano anche se definito protocolli chirurgici sono applicate8,9,10. È tipico per vedere una distribuzione bimodale di striatal piccolo e grande lesione striato-corticali volumi11. Per indurre l’ischemia, il filamento viene in genere inserito attraverso un’incisione del CCA o ECA che poi rimangono permanentemente legato12. La legatura permanente del CCA previene il ristabilimento del flusso sanguigno nell’arteria carotica interna (AIC) e, successivamente, il territorio MCA. In questo modo riperfusione essere affidamento su rifornimento collaterale all’interno del cerchio di Willis (mucca). La struttura di mucca ha variabilità anatomica tra singoli animali, particolarmente in C57BL/6 topi-un ceppo in genere utilizzato in vivo corsa ricerca13. Un metodo alternativo, di inserimento di filamento attraverso l’ECA, consentire la perfusione continua attraverso il CCA, ma compromessi questo metodo il rifornimento arterioso per il territorio ECA, che ha dimostrato, nei ratti, di avere un effetto negativo sull’animale benessere14.
L’affidamento sulla mucca per rifornimento collaterale e la riperfusione nel modello di MCAO stabilito può, in parte, spiegare la variabilità del volume di lesione dopo l’occlusione. Descriviamo una procedura chirurgica murina alternativa dove la legatura ECA è evitata e l’incisione di CCA è riparata, permettendo così di riperfusione attraverso il CCA, indipendente della mucca. La riparazione dell’incisione CCA precedentemente è stata indicata in ratti per provocare una riperfusione di successo attraverso il CCA15. Abbiamo applicato questo approccio con successo in topi11 e riferire qui il protocollo che si traduce in una ridotta variabilità nel volume della lesione, la misura di esito principale utilizzata negli studi di colpo sperimentale.
In questo protocollo, dimostriamo come intraprendere MCAO attraverso l’inserimento di filamento nave CCA seguita dalla riparazione del vaso CCA, che coinvolge un’applicazione di pad e sigillante di tessuto a consentire di riperfusione.
Induzione di filamento di MCAO transitorio nei roditori è il più frequentemente usato modello sperimentale del colpo, in quanto permette riperfusione all’area colpita, che imita il verificarsi di eventi segue clinica dell’ictus ischemico7. È segnalato qui un approccio chirurgico alternativo al tradizionale metodo di MCAO transitorio filamento-indotta in topi. L’approccio alternativo, che coinvolge il trattamento di analgesia, l’evitare di legatura di ECA e CCA incisione riparazione, si traduce in una ridotta variabilità di LV quando valutata facendo uso di metodi colorazione istologica11e di MRI.
Gli approcci tradizionali per indurre MCAO in gran parte si basano sul transection, o almeno la legatura, della Corte dei conti, che ha dimostrato, nei ratti, di influenzare il comportamento bevente e un aumento nella perdita di peso del corpo seguendo la MCAO14. Il protocollo definito qui, nei topi, con l’evitare la legatura ECA e aggiunta di analgesia, ha suggerito una riduzione di perdita di peso corporeo dopo MCAO con nessun effetto sul volume della lesione. L’uso di analgesia è evitato, o almeno non segnalato, nella maggior parte degli studi sperimentali ictus, a causa di possibili effetti confondenti sui risultati sperimentali. Tuttavia, evitando completamente l’analgesia non è sempre giustificata e c’è la necessità di bilanciare le esigenze di benessere degli animali con il raggiungimento degli obiettivi scientifici.
Differenze nella dimensione animale, deformazione e anatomia cerebrovascolare, oltre alle variazioni di dimensioni e tipo di filamento, ha suggerite di influenzare colpo risultati23,24. L’approccio alternativo descritto qui evita la dipendenza la mucca durante la riperfusione, riducendo così, almeno in parte, la variabilità osservata tra gli animali in volume della lesione. Anatomia di mucca è altamente variabile in topi, in particolare nella C57BL /6 ceppo, che è spesso utilizzata negli studi di colpo sperimentale. 90% dei topi C57BL/6 hanno una mucca incompleta a causa di una variegata posteriore comunicante dell’arteria (PcomA) l’evidenza, che può avere un effetto sul volume di danno ischemico dovuto la perfusione insufficiente di strutture di fuori del territorio MCA13, 25. riparazione del CCA in topi, come illustrato di seguito, si traduce nel ristabilimento del sangue flusso tramite il CCA alla zona ischemica, come precedentemente descritto in ratti15. Qui i dati rappresentativi dimostrano che la riparazione del CCA aumenta riperfusione, anche se il flusso di sangue in CCA non è stato misurato direttamente. Tuttavia, è possibile per il chirurgo di visualizzare il CCA rifluisca con sangue dopo la riparazione del vaso, come si ritorna ad uno stato palpitante e completo lungo tutto il tronco, prossimale e distale rispetto alla posizione di riparazione. Questa conferma visiva, insieme a letture di flussometria Doppler laser della zona ischemica, può essere utilizzata per confermare la riuscita riparazione della nave. Il tempo tra l’applicazione di rilievo del tessuto e la rimozione della clip nave da CCA possono avere un impatto sulla pervietà risultante del CCA, come riducendo il tempo tra l’applicazione di rilievo del tessuto e la rimozione di clip impedirà il pad tessuto aderendo all’o lato di trecenteschi del CCA. Anche se tecnicamente impegnativi, la procedura alternativa di MCAO spiegata qui non richiede alcuna abilità supplementari rispetto a quelli necessari per eseguire l’induzione chirurgica di MCAO nei topi.
Tradizionalmente associato con un’alta variabilità nelle misure di risultato, studi di colpo sperimentale possono avere la tendenza a essere sottodimensionato. Requisiti etici e di assistenza sociale in combinazione con preoccupazioni economiche e pratiche possono contribuire agli studi essere sottodimensionato. Riducendo la variabilità nel risultato e, di conseguenza, producendo esiti di lesione più coerente attraverso un gruppo sperimentale, i calcoli di potenza più efficaci possono essere eseguiti con l’obiettivo ultimo di studi viene alimentato in modo appropriato.
In conclusione, questa procedura di riparazione alternativa di CCA, nei topi, si traduce in minore variabilità nel volume della lesione sperimentale colpo seguente e calcoli di potenza più piccoli gruppi sperimentali consente di essere necessario per i test un effetto del trattamento quando appropriato vengono utilizzati.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal centro nazionale per la sostituzione, la raffinatezza e la riduzione degli animali nella ricerca (NC3Rs; NC/M000117/1 al centro di gravità). Gli autori ringraziano il personale della divisione di servizi biomediche, Università di Leicester, per la loro cura degli animali sperimentali e Maria Viskaduraki per la sua consulenza statistica. I risultati rappresentativi sono adattati con il permesso da modelli di malattia & meccanismi11.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |