Summary

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

Published: September 27, 2018
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Summary

Aqui, apresentamos dois protocolos para estudar interações do fagócito –Mycobacterium abscessus : a triagem de uma biblioteca de transposon mutant para deficiência intracellular bacteriana e a determinação de bactérias intracelular transcriptoma do RNA sequenciamento. Ambas as abordagens fornecem insights sobre as vantagens genômicas e adaptações de transcriptomic melhorar a aptidão de bactérias intracelulares.

Abstract

O que diferencia outras micobactérias saprófitas Mycobacterium abscessus é a capacidade de resistir a fagocitose por macrófagos humanos e a capacidade de se multiplicar no interior dessas células. Essas características de virulência processam M. abscessus patogênicos, especialmente em hosts vulneráveis com doença pulmonar estrutural subjacente, como fibrose cística, Bronquiectasia ou tuberculose. Como a doentes infectados com M. abscessus permanece obscuro. Ao contrário de muitos micobactérias, M. abscessus não é encontrado no ambiente, mas pode residir dentro as amebas, fagócitos ambientais que representam um potencial reservatório para M. abscessus. Com efeito, M. abscessus é resistente à fagocitose amoebal e a vida intra-ameba parece aumentar a virulência do M. abscessus em um modelo experimental de infecção. No entanto, pouco é conhecido sobre a virulência do M. abscessus em si. Para decifrar os genes que conferem uma vantagem para M. abscessus vida intracelular, uma triagem de uma biblioteca de mutante de transposon M. abscessus foi desenvolvida. Em paralelo, foi desenvolvido um método de extração de RNA de micobactérias intracelulares após co-cultura com amebas. Este método foi validado e permitiu o sequenciamento de todo M. abscessus transcriptomes no interior das células; fornecimento, pela primeira vez, uma visão global para M. abscessus adaptação à vida intracelular. Ambas as abordagens dão-em uma visão M. abscessus fatores de virulência que permitem a M. abscessus colonizar as vias aéreas em seres humanos.

Introduction

O gênero Mycobacterium inclui espécies que variam de organismos saprófitas inofensivos a principais patógenos humanos. Espécies patogénicas well-known tais como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans pertencem ao subgrupo de crescimento lento micobactérias (SGM). Em contraste, o subgrupo de rápido crescimento micobactérias (RGM) caracteriza-se pela sua capacidade de formar colônias visíveis em menos de 7 dias em ágar-ágar. O grupo RGM abrange mais de 180 espécies, principalmente de não-patogênicas micobactérias saprófitas. Estudos sobre RGM as interações com seus hospedeiros principalmente focado na Mycobacterium smegmatis e demonstram que estas micobactérias são rapidamente eliminadas pela ação bactericida dos macrófagos.

Mycobacterium abscessus é um do RGM rara que são patogénicas para os seres humanos e é responsável por uma vasta gama de infecções, que variam de pele e infecções de tecidos moles para as infecções pulmonares e disseminadas. M. abscessus é considerado, juntamente com Mycobacterium avium, o principal patógeno micobacteriana em pacientes de fibrose cística1.

Vários estudos realizados na M. abscessus indicam que este mycobacterium se comporta como um patógeno intracelular, capaz de sobreviver a resposta bactericida de macrófagos e fibroblastos nos pulmões e pele, o que não é normalmente observada em RGM 2 , 3 , 4. análise do genoma de M. abscessus identificou vias metabólicas, tipicamente encontradas em microrganismos ambientais em contacto com o solo, plantas e ambientes aquáticos, onde livre amebas são frequentemente presentes5. Eles também têm demonstrado que M. abscessus é dotado de vários genes de virulência não encontrados no RGM não-patogênicas e Saprófita, provavelmente adquirida pela transferência horizontal de genes em um nicho favorável a troca genética que pode reunir várias bactérias resistentes a ameba.

Experimentalmente, um dos primeiros resultados marcantes foi a observação de crescimento intracelular de M. abscessus em macrófagos, bem como para M. tuberculosis6. M. abscessus também resiste a acidificação do fagossoma, apoptose e autofagia, três mecanismos essenciais da resistência à infecção2celular. Ainda mostrou que a M. abscessus é capaz de estabelecer uma comunicação imediata entre o fagossoma e o citoplasma, um ambiente mais rico em nutrientes que pode favorecer a multiplicação bacteriana2. Muito pouco é conhecido sobre as vantagens de genômicas que M. abscessus possui ou adquiriu para permitir a sobrevivência em um ambiente intracelular. Coculture ameba é um método eficiente que permitiu o isolamento de muitas novas bactérias resistentes a ameba como Mycobacterium massiliense7,8. A capacidade de se multiplicar dentro de amebas observou-se, em um modelo de clorofórmio de M. abscessus em ratos, que pode conferir uma maior virulência de M. abscessus4. Uma hipótese é que a M. abscessus desenvolveram características genéticas encontradas dentro deste ambiente para sobreviver nas células fagocíticas, que são diferentes das outra RGM não patogénicas. Essas aquisições podem favorecer a capacidade de se espalhar e sua virulência no hospedeiro humano.

Este relatório descreve ferramentas e métodos para destacar as vantagens de genômicas conferidas para M. abscessus para sobreviver no ambiente de amebas. Para este efeito, a seleção de mutantes de transposon M. abscessus é descrita pela primeira vez, na estirpe do tipo a Acanthamoeba castellanii , que permite a identificação de defeituoso do mutante para crescimento intracelular. Uma segunda triagem em macrófagos também é relatada, para confirmar se esse defeito persiste no hospedeiro humano. Em segundo lugar, para entender que mecanismos são aproveitados em M. abscessus se adaptar à vida em fagocíticas células e aumentar sua virulência no animal de acolhimento, um método especificamente adaptado para M. abscessus foi desenvolveram, depois da co-cultura na presença de amebas que permitiu a extração de RNA total de bactérias intra-amoebal. Como consequência, uma visão abrangente de M. abscessus genes que são necessários para uma vida intracelular foi desenvolvida.

Protocol

1. Biblioteca triagem Construção da biblioteca mutante Tn Obter uma biblioteca de transposon.Nota: Para este experimento, uma biblioteca de transposon mutant foi obtida E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, EUA. A biblioteca foi construída de uma suave tensão clínica (43S) da M. abscessus complexo (M. abscessus subsp. massiliense) com um phagemid introduzido por M. abscessus , permitindo a inserção aleatória de um…

Representative Results

M. abscessus tem a capacidade de resistir e fugir das respostas bactericidas de macrófagos e ambientais protozoários como as amebas. M. abscessus expressa fatores de virulência quando cultivada em contacto com as amebas, que o torna mais virulento em ratos4. O primeiro objetivo desses métodos era identificar os genes presentes no M. abscessus , permitindo sua sobrevivência e multiplicação dentro de amebas. <p class="jove_conten…

Discussion

O comportamento de M. abscessus é muito mais semelhante ao comportamento da SGM patogénico, tais como M. tuberculosis do que qualquer outras micobactérias pertencentes a RGM2. O elemento chave na patogenicidade de SGM é sua capacidade de sobreviver ou até mesmo se multiplicam dentro de células apresentadoras de antígeno, tais como macrófagos e células dendríticas.

M. abscessus adquiriu certas vantagens genômicas como mostrado pela s…

Acknowledgements

Reconhecemos grandemente PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, EUA) para o dom precioso do mutante biblioteca e o Dr. Ben Marshall (Faculdade de medicina, Universidade de Southampton, Reino Unido) para as correções do manuscrito. Muito reconhecemos associação francesa do paciente para fibrose cística “Vaincre la Mucoviscidose” e “L’Association Gregory Lemarchal” pelo apoio financeiro (RF20150501377). Agradecemos também a Agência Nacional para a investigação (programa ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) e a modernização de Région (Domaine d’Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) para o financiamento a postdoctoral fellowship para V.I.C.T.I.M.S.W.V.-M. L. L. é um colega de doutorado do “Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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