Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için
Summary
Burada, hücre –Mycobacterium abscessus etkileşimleri çalışmaya iki protokol mevcut: transposon mutant kitaplığa bakteriyel hücre içi eksikliği ve bakteriyel hücre içi transcriptome RNA üzerinden belirlenmesi için tarama sıralama. Her iki yaklaşımın genomik avantajları ve hücre içi bakteri fitness artırılması transcriptomic uyarlama içgörü sağlamak.
Abstract
Ne diğer saprofit mikobakteriler Mycobacterium abscessus farkı insan makrofajlar tarafından fagositoz direnmeye becerisi ve yeteneği bu tür hücrelerin içinde çarpmak için olduğunu. Bu virülans Özellikler M. abscessus patojen, özellikle de temel yapısal akciğer hastalığı, kistik fibrozis, bronşiektazi veya tüberküloz gibi savunmasız ailelerle render. Nasıl hastalar M. abscessus ile enfekte olma belirsizdir. Aksine birçok mikobakteriler, M. abscessus ortamında bulunmayan ancak amip, M. abscessusiçin potansiyel bir rezervuar temsil çevre fagositler içinde bulunur. Nitekim, M. abscessus amoebal fagositoz dayanıklıdır ve M. abscessus virülans enfeksiyon, deneysel bir modeli artırmak için Intra-amip hayat gibi görünüyor. Ancak, az M. abscessus virülans kendisi hakkında bilinir. M. abscessus hücre içi yaşam için bir avantaj veriyor genlerin deşifre için M. abscessus transposon mutant kitaplığa bir tarama geliştirilmiştir. Buna paralel olarak, hücre içi mikobakteriler RNA çıkarma amip ile ortak kültür sonra bir yöntem geliştirildi. Bu yöntem doğrulanmış ve bütün M. abscessus sıralama izin transcriptomes hücrelere; , ilk kez, M. abscessus adaptasyon hücre içi yaşam için bir genel görünüm sağlar. Her iki yaklaşımın insanlarda airways kolonize etmek M. abscessus etkinleştirmek M. abscessus virülans faktörleri içine bir fikir verin.
Introduction
Cins Mycobacterium zararsız saprofit canlılar için büyük insan patojenleri değişen türler içerir. Mycobacterium tüberküloz, Mycobacterium marinum ve Mycobacterium ulcerans gibi iyi bilinen patojen türün ait yavaş büyüyen alt için mikobakteriler (SGM). Buna karşılık, alt grup hızlı büyüyen mikobakteriler (RGM) 7 günden daha az sürede agar ortamdaki görülebilir koloniler kurmaya yeteneklerini karakterizedir. RGM grup 180’den fazla tür, özellikle patojenik olmayan saprofit mikobakteriler oluşmaktadır. Onların ana bilgisayarlarla RGM etkileşimleri üzerinde çalışmalar çoğunlukla Mycobacterium smegmatis üzerinde odaklanmıştır ve bu mikobakteriler makrofajlar bakterisidal eylem tarafından hızla ortadan kalkar gösterilmektedir.
Mycobacterium abscessus insanlara patojenik nadir RGM biridir ve çok çeşitli deri ve yumuşak doku enfeksiyonları pulmoner ve dissemine enfeksiyonlara karşı değişen enfeksiyonlar sorumludur. M. abscessus , Mycobacterium aviumile birlikte, kistik fibrozis hastalarının1ana Mikobakteriyel patojen olarak kabul edilir.
Bu yol hücre içi bir patojen, makrofaj ve fibroblast akciğer ve deri, genellikle RGM içinde gözlenen değil bakteri yok edici yanıt kalan yeteneğine gibi davranır M. abscessus üzerinde yapılan çeşitli araştırmalar gösteriyor 2 , 3 , 4. M. abscessus Genom Analizi metabolik yollar genellikle çevresel mikroorganizmaların toprak ile temas halinde bulunan tespit, bitkiler ve su ortamları, nerede ücretsiz amip çoğu kez mevcut5. Onlar de M. abscessus muhtemelen yatay gen transferi bir niş toplamak genetik Exchange’e olumlu tarafından alınan saprofit ve patojenik olmayan RGM bulunamadı birkaç virülans genler ile donatılmış olan göstermiştir çeşitli amip dirençli bakteri.
Deneysel, ilk çarpıcı sonuçlardan biri de M. tuberculosis6gelince makrofajlar M. abscessus hücre içi büyüme gözlem idi. M. abscessus da phagosome, apoptozis ve autophagy, üç temel mekanizmaları enfeksiyon2hücresel direnç asitleştirme direnir. Hatta M. abscessus phagosome ve sitozol, bakteriyel çarpma2lehine bir daha fazla besin zengin ortam arasında hemen bir iletişim kurmak mümkün olduğunu gösterilmiştir. Çok az M. abscessus sahip veya hücre içi bir ortamda hayatta kalma izin vermek için satın aldı genomik avantajları hakkında bilinir. Amip coculture birçok yeni amip dirençli bakteri yalıtım Mycobacterium massiliense7,8olarak izin verimli bir yöntemdir. M. abscessus kloroformu farelerde, M. abscessus4artan bir virülans görüşmek, bir modeli içinde amip çarpmak için bir yetenek gözlendi. M. abscessus genetik özellikleri patojenik olmayan diğer RGM farklı fagositik hücreleri hayatta kalmak için bu ortamda karşılaştı gelişen bir hipotezdir. Bu satın alma yeteneği yaymak için ve onun virülans insan ev sahibi lehine.
Bu rapor araç ve amip ortamda hayatta kalmak için M. abscessus haiz genomik avantajları vurgulamak için yöntemleri açıklar. Bu amaçla, M. abscessus transposon mutantlar ile taranması ilk, mutantın arızalı hücre içi büyüme için kimliği sağlar Acanthamoeba castellanii türü zorlanma üzerinde tanımlanır. Makrofajlar içinde ikinci bir tarama, bu kusur insan konukçuda devam edip etmediğini onaylamak için de bildirilmektedir. İkinci olarak, hangi mekanizmalar fagositik hayata adapte M. abscessus harnessed vardır anlamak için hücreleri ve onun virülans hayvan ev sahibi, M. abscessus için özel olarak uyarlanmış bir yöntem olduğunu artış, sonra ortak kültür geliştirilen Toplam RNA çıkarma içi amoebal bakteri izin amip huzurunda. Sonuç olarak, hücre içi bir yaşam için gerekli olan M. abscessus genler kapsamlı bir görünümünü geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
M. abscessus çok daha benzer patojenik SGM M. tuberculosis gibi davranışını RGM2‘ ye ait diğer mikobakteriler daha bir davranıştır. Anahtar SGM patojenitesi, hayatta ya da antijen sunan hücreler gibi makrofaj ve dendritik hücreler içinde bile çarpmak için yeteneklerini öğedir.
M. abscessus genomik bazı avantajları bir ökaryotik fagositik hücre içinde hayatta kalmak için onun genom14 toplam sırası…
Acknowledgements
Biz büyük ölçüde mutant değerli hediye için PR EJ Rubin (Harvard Tıp Okulu, Boston, ABD) kabul Kütüphane ve Ben Marshall’ın (Tıp Fakültesi, Southampton Üniversitesi, İngiltere) el yazması düzeltmeler için. Biz büyük ölçüde Fransızca hasta Derneği kistik fibrozis “Vaincre la Mucoviscidose” ve “L’Association Gregory Lemarchal” için mali destek (RF20150501377) için kabul edersiniz. Biz de araştırma (ANR programı DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) ve Région Ile-de-France için Ulusal Ajans teşekkür (Domaine d’Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) V.L-m doktora sonrası bursu finansman için. L. l. doktora bir dost “Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
Referencias
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
