Summary

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Published: April 16, 2018
doi:

Summary

여기 선물이 전체 셀 전기 화학 실험 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 복잡 한 외부 막 한다 통해 extracellular 전자 전송의 속도를 양성자 수송의 기여를 공부 하는 프로토콜.

Abstract

직접 c의 전기 화학 검출-시 토 크롬 단지 세균 외부 막에 포함 된 입력 (외부 막 c-입력 시 토 크롬 복합물; 톰 c-대련 청 려)는 최근 소설 전체 셀 셀 외관 호흡기 체인에서 세균성 전자 수송 특성 분석 방법으로, 세포 외 전자 전송 (동유럽 표준시)로. 통로 동유럽 표준시 반응 동안 전자 흐름의 속도, 조사 하는 동안 전체 셀 전기 메서드 동유럽 표준시와 관련 된 양이온 수송의 영향 검토를 하지 아직 설립 되었습니다. 현재 연구에서 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE) 동유럽 표준시에 옴 c를 검사 하는 생 화 확 적인 기술의 예-대련 청 려 모델 미생물, Shewanella oneidensis 미스터-1을 사용 하 여 설명 되어 있습니다. 동유럽 표준시 프로세스에 KIE 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려 미생물 현재 생산에서 속도 제한 단계 역할을 하는 경우에 얻어질 수 있다. 끝으로, D2O의 추가 하기 전에 표면에 뜨는 솔루션 업스트림 신진 대사 반응의 속도 지원 하 고 유니폼에서 planktonic 세포를 제거 하는 전자 기증자의 충분 한 금액을 포함 하는 신선한 미디어로 대체 되었습니다. 작업 전극에 단층 biofilm입니다. 속도 제한 확인 대체 방법을 미생물 현재 생산에서 단계 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려도 설명 됩니다. 양성자 전송 속도 론 조사를 위한 전기 화학 분석 결과 전체 셀의 우리의 기술은 다른 electroactive 미생물 계통에 적용할 수 있습니다.

Introduction

직접 하는 그대로 세균 세포에서 산화 환 원 단백질 전기 기술을 최근 금속 감소 미생물 긴장, S. oneidensis 씨-1 등 Geobacter sulfurreducens PCA의 발견 이후 등장 외부 막 시 토 크롬 c 형 단지 (OM c-대련 청 려) 셀 외부1,2,3,,45에 노출 되어 있다. 톰 c-대련 청 려 호흡기 체인에서 extracellularly 있는 고체 기판에 전자 수송 중재. 이 전송 extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시)1,6 이라고 하 고 미생물 연료 전지6등 신흥 바이오에 대 한 중요 한 과정 이다. 따라서, 기본 동유럽 표준시 속도 론 및 메커니즘 및 미생물 생리학에 그것의 연결을 이해 하 옴 c-대련 청 려 되었습니다 조사 전체 셀 전기 화학4,7, 현미경과 결합을 사용 하 여 8 , 9, 분광학10,11, 그리고 분자 생물학2,4. 반면, 동유럽 표준시 관련 된 양이온 수송, 예를 들어, 양성자, 살아있는 세포에서 동유럽 표준시 활동에 미치는 영향을 조사 하는 방법 부족 하 게 설립 되어, 세균 막 중요 한 역할을가지고 걸쳐 양성자 수송에도 불구 하 고 신호, 항상성, 및 에너지 생산12,,1314. 현재의에서 연구, 우리는 양성자 수송 필요의 속도 제한 단계 식별 전체 셀 전기 화학 측정을 사용 하 여 S. oneidensis 씨-1 셀에 동유럽 표준시 활동에의 영향을 검사 하는 기법을 설명 미생물 현재 생산15.

1 직접 연결 된 동유럽 표준시에 양성자 수송의 기여를 평가 방법은 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE)입니다. 인기의 전자 전송 속도 론16양성자 교통 영향을 나타내는 중수소 이온, 양성자의 교체 시 전자 전송 속도에서 변화 관찰입니다. KIE 자체의 이론은 잘 설립 되었습니다 정제 효소17전기 화학 측정을 사용 하 여. 그러나, S. oneidensis 씨-1에 현재 생산, 여러 다양 한, 그리고 변동 과정18에서 결과, 이후 하나 확인할 수 없습니다 단순히 동유럽 표준시 속도 제한 과정으로. 관찰 하기 위해 동유럽 표준시 함께 양성자 전송 프로세스에 인기, 우리는 미생물 현재 생산 옴 c통해 전자 전송에 의해 제한 됩니다 확인 해야-대련 청 려 전극에. 이 목적을 위해 우리 신선한 매체에서 최적 pH 및 온도 조건 KIE 측정; 전에 전자 기증자로 젖 산의 높은 농도 포함 하는 표면에 뜨는 솔루션 대체 이 교체 봉사 두 역할: (1) 동유럽 표준시에 비해 업스트림 신진 대사 과정의 속도 향상 하 고 (2) 작업 전극 (에 S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 발표 하는 상쾌한 수영 셀 생략 인듐 주석 첨가 산화물 (ITO) 전극). 새로운 실무자 유지 하 고 동유럽 표준시 프로세스 속도 결정 단계는 확인을 있도록 제시 상세한 프로토콜 것입니다.

Protocol

1. ITO 전극 (그림 1)에 S. oneidensis 씨-1의 단층 Biofilm의 형성 참고: 다른 미생물과 전기 화학 반응 기의 오염을 방지 하기 위해, 모든 미디어, 구현 및 전기 화학 반응 기의 구성 한다 살 균 되어야 사전에. 때 깨끗 한 벤치에 모든 절차를 지휘 한다 S. oneidensis 씨-1 셀을 사용 하 고 전기 원자로 건설. S. oneidensis 씨-1 셀의 재배참고:…

Representative Results

0.4 V (그녀) 대에서 잠재적인 응용 프로그램의 25 h, 후 단층 biofilm 이전 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는4confocal 현미경 검사 법 의해 확인 되었다 이토 유리의 작업 전극에 형성 되었다. 단층 biofilm의 형성 중 S. oneidensis 씨-1에서 현재 생산의 대표적인 시간 과정은 그림 2에 표시 됩니다. 비록 현재는 모든 측정에 변경, 단층 biofi…

Discussion

우리의 전체 셀 전기 화학 분석 결과 단백질 전기에 비해 몇 가지 기술적인 이점이 있다. 단백질 정화 다단계 시간이 걸리는 절차 필요, 우리의 전체 셀 메서드 자체 조직된 biofilm 형성 세포 배양 후의 어느 날 걸립니다. 톰 c간의 안정적인 상호 작용을 달성 하기 위해-대련 청 려 고 전극, 우리 필요만 살 균과 청소의 전극 표면; 톰 c를 향하는 동안, 전극에 부착 단백질4</su…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 24000010, 17 H 04969, 일본 사회에서 특별히 추진 연구 및 JP17J02602, 미국 사무실의 해군 연구 글로벌 (N62909-17-1-2038)는 선진적인 재정적으로 지원 했다. Y.T.는 JSP 연구원 이며 프로그램을 통해 JSP에 대 한 선도 대학원 학교 (공로) 지원.

Materials

Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments

Referencias

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Play Video

Citar este artículo
Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).

View Video