JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Published: April 16, 2018
doi:
10.3791/57584
, ,
1Department of Applied Chemistry,University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science,National Institute for Materials Science

Summary

Burada bir protokol proton taşıma dış membran cytochromes Shewanella Corynebacterium Bay-1’karmaşık yoluyla ekstraselüler elektron taşıma oranı katkısını çalışmaya bütün hücreli elektrokimyasal deneyler mevcut.

Abstract

Doğrudan celektrokimyasal tespiti-yazın bakteriyel dış membran gömülü sitokrom kompleksleri (dış membran c-sitokrom kompleksleri; yazın OM c– Cyts) son zamanlarda roman bütün hücreli analitik yöntem bakteriyel hücre dış elektron ulaşım solunum zincirindeki karakterize olarak ortaya, ekstrasellüler elektron taşıma (EET) anılacaktır. Yol ve Kinetik elektron akışı EET reaksiyon sırasında araştırdık iken, katyon taşıma EET ile ilişkili etkisini incelemek için bir bütün-hücre elektrokimyasal yöntem henüz oluşturulmadı. Bu da çalışmanın, döteryum Kinetik izotop etkisi (KIE) EET OM cile incelemek için biyokimyasal bir teknik – Cyts modeli mikrop, Shewanella Corynebacterium Bay-1, kullanarak açıklanan örneğidir. EET ile OM c– Cyts mikrobiyal geçerli üretim hızı sınırlaması adım olarak davranıyorsa KIE EET süreci üzerinde elde edilebilir. Bu amaçla, D2O, eklenmesi önce süpernatant çözüm elektron verici ters yönde metabolik reaksiyonların hızı desteği ve planktonik hücreleri bir üniforma kaldırmak için yeterli miktarda içeren taze medya ile değiştirildi monolayer biyofilm çalışma elektrot üzerinde. Hızı sınırlaması onaylamak için alternatif yöntemler adım mikrobiyal geçerli üretimde EET OM caracılığıyla olarak – Cyts da açıklanmaktadır. Proton taşıma Kinetik soruşturma için bütün hücreli elektrokimyasal testin bizim tekniği diğer electroactive mikrobiyal suşları için uygulanabilir.

Introduction

Doğrudan sağlam bir bakteri hücre bir Redoks protein karakterize etmek için elektrokimyasal teknikler S. Corynebacterium Bay-1 veya Geobacter sulfurreducens PCA gibi metal azaltarak mikrobiyal suşları keşfinden beri son zamanlarda ortaya çıkmıştır, hangi dış membran c tipi sitokrom kompleksleri (OM c-Cyts) hücre dış1,2,3,4,5‘ e maruz var. COM – Cyts solunum zinciri elektron taşıma extracellularly bulunan katı yüzeyler için aracılık. Bu aktarım için hücre dışı elektron taşıma (EET)1,6 adlandırılır ve mikrobiyal yakıt hücreleri6gibi gelişmekte olan biyoteknoloji için kritik bir süreçtir. Bu nedenle, temel EET kinetik ve mekanizmaları ve mikrobiyal Fizyoloji onun bağlantı anlamak için OM c –Cyts araştırdık mikroskobu ile birlikte bütün hücreli elektrokimya4,7, kullanma 8 , 9, spektroskopi10,11ve moleküler biyoloji2,4. Buna ek olarak, katyon EET ilişkili taşıma, Örneğin, proton, canlı hücreler EET Kinetik üzerinde etkisini araştırmak için yöntemleri pek, proton taşıma bakteri membranları kritik bir rol almakla genelinde rağmen kurulmuştur sinyal, Homeostazı, enerji üretim12,13,ve14. Mevcut çalışma, biz proton taşıma EET Kinetik hızı sınırlaması adımda tanımlaması gerektirir bütün hücreli elektrokimyasal ölçüler kullanarak S. Corynebacterium Bay-1 hücrenin üzerinde etkisini incelemek için bir teknik tarif mikrobiyal geçerli üretim15.

Proton taşıma ilişkili EET Tarih katkısını değerlendirmek için bir doğrudan döteryum Kinetik izotop etkisi (KIE) yoludur. KIE elektron transferi Kinetik proton taşıma elektron transferi Kinetik16etkisini temsil eden yedek proton döteryum iyonları ile üzerine değişiklik gözlemlenebilir gibidir. KIE kendisi teori de arıtılmış enzimler17ile elektrokimyasal ölçüler kullanarak kurulan olmamıştı. Geçerli üretim S. Corynebacterium Bay-1 birden çok, farklı ve dalgalanan işlemleri18sonuç beri Ancak, biri sadece EET hızı sınırlaması işlem olarak belirleyemez. KIE proton taşıma süreçleri EET ile birleştiğinde gözlemlemek için biz mikrobiyal geçerli üretim ile elektron taşıma OM cile sınırlıdır onaylamanız gerekir – Cyts elektrot için. Bu amaçla, biz taze orta laktat yüksek bir konsantrasyon en uygun pH ve sıcaklık koşullarında KIE ölçüm önce bir elektron donör olarak içeren süpernatant çözüm yerine; Bu değiştirme iki rolden servis: (1) için EET göre ters yönde metabolik süreçleri oranı gelişmiş ve (2) S. Corynebacterium Bay-1 üzerinde çalışma elektrot (monolayer biyofilm serbest süpernatant Yüzme hücrelerde ihmal indiyum teneke katkılı oksit (ITO) elektrot). Sunulan ayrıntılı iletişim kuralı korumak ve EET işlem oranı belirleme adım olduğunu doğrulayın yeni uygulayıcıları yardımcı olmak içindir.

Protocol

1. S. Corynebacterium Bay-1 bir Ito elektrot (şekil 1)’in Monolayer biyofilm oluşumu Not: elektrokimyasal reaktör diğer mikroplar ile kontaminasyonu önlemek için tüm medya, uygular ve elektrokimyasal reaktör bileşenlerini önceden sterilize. Ne zaman tüm yordamları S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri kullanarak ve elektrokimyasal reaktörler inşa, temiz bir bankta yapılmalıdır. S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri…

Representative Results

0,4 V (SHE karşı) potansiyel uygulamasının 25 h sonra monolayer biyofilm çalışma elektrot daha önce bir tarama elektron mikroskobu ya da bir confocal mikroskobu4tarafından doğrulandı ITO cam kuruldu. S. Corynebacterium Bay-1’den geçerli üretim monolayer biyofilm oluşumu sırasında temsilcisi zaman tabii Şekil 2′ de gösterilmiştir. Her ne kadar mevcut her ölçüm değiştirir, eğer monolayer biyofilm eşit o…

Discussion

Bizim bütün hücreli elektrokimyasal tahlil protein elektrokimya ile karşılaştırıldığında çeşitli teknik avantajları vardır. Protein saflaştırma Multi-step zaman alıcı yordamlar gerektirir, bizim bütün hücreli yöntemi hücre kültürü sonra kendi kendine organize biyofilm oluşumu bir gün alır. OM carasında istikrarlı bir etkileşim elde etmek için – Cyts ve elektrot, biz sadece sterilizasyon ve elektrot yüzeyi Temizleme proteinler4, örneğin, Co…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser mali özel olarak terfi araştırma–dan Japonya toplum için bilim promosyon (JSP’ler) KAKENHI Grant sayı 24000010, 17 H 04969 ve JP17J02602, bizi Office, deniz araştırma Global (N62909-17-1-2038) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir. Y.T. JSP’ler araştırma görevlisi ve önde gelen lisansüstü okulları (hak) için Program sayesinde JSP’ler tarafından desteklenen.

Materials

Glass cylinder N/A N/A Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base N/A N/A Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber N/A N/A Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa GL Science 3007-16101 Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode GEOMATEC No.0001 Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode HOKUTO DENKO HX-R5 Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire The Nilaco Cooporation PT-351325 Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller Becton, Dichkinson and Company 244620 Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agar Becton, Dichkinson and Company 214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) TCI A1428
Flavin mononucleotide (FMN) Wako 184-00831
NaHCO3 Wako 191-01305 Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2O Wako 031-00435 Used for DM
NH4Cl Wako 011-03015 Used for DM
MgCl2 · 6H2O Wako 135-00165 Used for DM
NaCl Wako 191-01665 Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) DOJINDO 346-08235 Used for DM
Sodium Lactate Solution Wako 195-02305
Bacto Yeast Extract Becton, Dichkinson and Company 212750
Deuterium oxide (D, 99.9%) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-PK Additive for kinetic isotope effect experiments
Incubator TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. LTI-601SD Used for precultivation
Shaker TAITEC NR-3 Used for precultivation
Autoclave machine TOMY SEIKO CO. LTD. LSX-500 Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench SANYO MCV-91BNF Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator Eppendorf 5430R Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator Puequ CO. LTD. PNTN-2 Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer SHIMADZU UV-1800 Used for optimization of cell density
Potentiostat BioLogic VMP3 Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator AS ONE TR-1A Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage HOKUTO DENKO HS-201S Used for electrochemical experiments
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Tags

Deuterium Kinetic Isotope EffectExtracellular Electron TransportShewanella Oneidensis MR-1Electrochemical DetectionProton TransportC-type CytochromesThree-electrode Electrochemical ReactorITO SubstrateAnaerobic ConditionsLactateYeast Extract

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image