Summary

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

Abstract

여기, 우리는 전체 산 성인 귀 피부 세포 수준에서 면역 세포 분포 뿐 아니라 포괄적인 3 차원 신경-혈관 분기 morphogenesis 패턴화, 공부 하 기술 이미징의 프로토콜 제시. 성인 조직에 주변 신경 및 혈관 해 부 구조 분석 기능 신경-혈관 배선 및 상처 치유 등의 병 적인 상태에 신경-혈관 변성의 이해에 몇 가지 통찰력을 제공합니다. 매우 유익한 모델 시스템으로 우리 해 부에 쉽게 접근할 수 있는 성인 귀 피부에 우리의 연구를 집중 했다. 전체 피부, 말 초 신경 (감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 세포), 혈관 (내 피 세포와 혈관 평활 근 세포에서에서 세포 구성 성분의 정확한 묘사를 제공 하는 우리의 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜 ), 그리고 선 동적인 세포. 우리는이 프로토콜 주변 신경 및 혈관에 있는 형태학 적 이상 뿐만 아니라 다른 병 적인 조건 하에서 성인 귀 피부에 염증을 조사 하는 방법을 포장 됩니다 믿습니다.

Introduction

피부는 3 개의 층으로 이루어져: 표 피, 진 피 및 hypodermis. 그것은 줄기 세포 유지 보수, 차별화, 및 개발으로 재생, tumorigenesis, 및 성인에서 염증 morphogenesis 공부를 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 피부 나가도록 풍부한 이며 innervated 주변 신경 및 혈관 시스템의 개발은 잘 조정 되도록 합니다.

우리는 이전 여러 라벨 그대로 주변 신경 및 혈관 그들의 세포질 구성 요소1,2,3, 를 포함 하 여 공부를 함께 전체-마운트 배아 피부 이미징 기술을 증명 하고있다 4: 감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 신경 세포, 내 피 세포, pericytes, 및 혈관에 혈관 부드러운 근육 세포 (VSMCs). 신생, 동안 기본 모 세관 네트워크 집중적인 혈관 개장 겪 습와 계층적 혈관 분기 네트워크로 개발. 개발 진 피 하거나 hypodermis 동맥 말 초 감각 신경 및 혈관 분기 다음 동맥에 인접 한 양식. 계층적 혈관 네트워크는 철저 하 게 VSMCs 덮여, 후 교감 신경 따라 확장 하 고 큰 직경 혈관1,,56을 자극. 개발 신경 및 혈관 시스템 사이 가까운 협회에 중요성에도 불구 하 고 주요 질문 성인에서 다양 한 병 적인 상황에서 신경-혈관 네트워크에 어떻게 해결 되었습니다. 3-차원 고해상도 영상 해부학 인식할 수 분기 morphogenesis 및 패터 닝 pathogenesis 감사 필요가 있다.

성인 마우스 피부에서 신경 및 혈관 morphogenesis 조직 섹션 얼룩에 의해 일반적으로 분석 된다. 다른 연구 주변 신경 및 혈관, 모 낭, 피지 선 땀 샘, 및 arrector pili 근육7,,89시각화 하 피부 전체 마운트 이미지를 사용 했습니다. 그러나, 성인 피부 두께 전체 깊이에 피부를 분석 하기 어려운 하 게 했다.

현재 연구에서 우리는 이러한 과제를 극복 하기 위해 성인 귀 피부의 새로운 고해상도 전체 마운트 이미징 개발. 귀 피부는 쉽게 액세스할 수 해 부 및 피부 이후 전체 마운트 이미징에 대 한 그것의 전체 깊이 통해. 따라서, 포괄적인 부 량 측정, 피부에 주변 신경 및 혈관 시스템의 3 차원 구조를 비교에 적용 될 수 있는 간단 하 고 매우 재현 방법입니다. 우리는 큰 직경 혈관 주변 감각 및 교감 신경의 맞춤 성인 피부에서 유지 됩니다 설명 했다. 이 프로토콜의 목표는 분기 morphogenesis, 및 주변 신경 및 혈관, 뿐만 아니라 염증 등 다양 한 조건에서 성인 마우스 모델에서 세포 수준에서 면역 세포 분포의 패턴을 시각화 하 고 재생입니다.

Protocol

이 섹션에서 모든 실험 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI) 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인에서 수행 했다. 1. 성인 마우스 귀 피부 컬렉션 닫힌된 챔버에 이산화탄소 (CO2) 노출 성인 쥐를 안락사 고 자 궁 탈으로는 안락사를 확인 합니다.참고: 실험 안락사 방법에 대 한 국립 보건원 (NIH) 지침을 따릅니다. 베이스에서 귀 부하 고 35 x 10 m m2 …

Representative Results

성인 마우스 후부 귀 피부 (그림 1A)와 귀 앞쪽 피부 (그림 1B) 했다 αSMA (레드), Tuj1 (녹색), 항 체와 함께 immunostained 및 PECAM-1 (파란색). 후부 피부 immunostained 신경-면역 배포 CD11b (적색) 및 MBP (녹색), Tuj1 (파란색)와 (그림 2A)에 항 체를 사용 하 여 공부를 했다. CD11b의+ 염증 세포, 대 식 세포를 포함 하 ?…

Discussion

이 프로토콜 성인 귀 피부 신경-혈관 구조와 면역 세포 분포의 분석에 대 한 전체-마운트 immunonohistochemical 영상을 설명합니다. 우리는이 방법은 장점이 수많은 실험 연구자 분기 morphogenesis 주변 신경 및 혈관의 패턴화와 면역 세포와 머리를 포함 하 여 피부 구성의 3 차원 분포 연구에 대 한 생각 모 공입니다. 화상의 결과 추가 정량 분석에 대 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 측정할 수 있습니다…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 실험실 관리 K. 길 감사, 기술 지원, 제이 호킨스와 직원의 국립 보건원 (NIH) 건물 50 동물 마우스 관심과 R. 리드와 지원에 대 한 시설과 관리 지원에 대 한 F. Baldrey. 공유 감사 미 링크를 사와 M. Udey에 또한 그들의 귀 피부 해 부 프로토콜, 편집 도움말 및 줄기 세포 연구실의 구성원에 대 한 명. 화상 및 기술 도움말 및 사려깊은 토론에 대 한 신경-혈관 생물학. 토니 야 마자 키 과학 진흥 (JSP) NIH-KAITOKU에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다. 이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (HL005702-11 사원)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

Referencias

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).

Play Video

Citar este artículo
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

View Video