Summary

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデル システム

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

ここでは、分岐の形態形成および末梢神経、血管、免疫細胞分布のパターンを視覚化することを可能にする全体の大人マウス耳介皮膚に高解像度全体マウント画像処理手法について述べる。

Abstract

ここでは、包括的な三次元神経血管の分岐形態形成、パターニング、細胞レベルでの免疫細胞の分布を研究するイメージング全体マウント大人の耳皮のプロトコルを提案します。成体組織の末梢神経や血管の解剖学的構造の解析は、神経血管機能の配線と創傷治癒など病態における神経血管変性の理解にいくつかの洞察を提供します。非常に有益なモデル システムとして解離しやすく、大人の耳の皮膚に私たちの研究をしました。私たちのシンプルで再現性のあるプロトコルが全身の皮膚、末梢神経 (感覚軸索、交感神経の軸索とシュワン細胞) など血管 (血管内皮細胞と血管平滑筋細胞の細胞内成分の正確な描写を提供します)、および炎症性細胞。このプロトコルは異なる病態下大人の耳の皮膚の炎症だけでなく、末梢神経や血管の形態異常を調査する道を開くだろうと考えています。

Introduction

皮膚は 3 つの層で構成されています: 表皮、真皮および皮下。それは、研究開発と同様に再生、腫瘍、および大人の炎症の形態形成、分化、幹細胞維持にモデル システムとして使用されています。皮膚はさまざまな血管や末梢神経系と血管系の開発がとれたように支配されています。

以前そのままの末梢神経や血管、細胞成分1,2,3,を含む研究に複数付け全体マウント胚皮膚イメージングを実現しました。4: 感覚軸索、交感神経の軸索、シュワン神経細胞、内皮細胞、周、血管での血管平滑筋細胞 (VSMCs)。血管新生、中にプライマリ毛細血管網は集中血管リモデリングを受け、階層型血管分岐ネットワークに発展します。発展途上の真皮・皮下、動脈末梢感覚神経と静脈と一緒に分岐し、動脈に隣接して形成します。階層型の血管のネットワークは、VSMCs で覆われて徹底的に、交感神経に沿って延びるし、大径血管1,5,6を支配します。密接に関連開発神経系と血管系の意義、にもかかわらず主要な質問は大人でさまざまな病的状況で神経・血管のネットワークはどう対処してきました。三次元高分解能イメージングは、解剖学的に認識可能な形態とパターニングの病因を理解する必要です。

アダルト マウス皮膚の神経と血管の形態形成をよくティッシュ セクションの汚損によって解析しました。他の研究は、末梢神経、毛包、皮脂腺、arrector pili 筋肉7,8,9に加えて、血管を可視化するのに皮膚の全体マウント画像を使用しています。ただし、成人の皮膚の厚さは、その全体の深さで皮膚を分析することは困難が。

本研究では、大人の耳皮膚これらの課題を克服するための新高解像度全取り付けるイメージングを開発しました。耳の皮膚はその全体の深さを郭清と皮膚の後続の全体マウント イメージングの容易にアクセス可能です。したがって、包括的な定量化測定で、皮膚の末梢神経系と血管系の三次元のアーキテクチャを比較に適用することができます簡単で再現性の高い方法です。大人の肌に大径血管と末梢の感覚と交感神経神経の配置が保持されることを行った。このプロトコルの目標分岐の形態形成と末梢神経、血管、炎症など様々 な条件下で成体マウス モデルにおける細胞レベルでの免疫細胞の分布のパターンを視覚化することですし、再生。

Protocol

このセクションのすべての実験は、国立心臓、肺および血の協会 (NHLBI) 動物のケアおよび使用委員会の承認の下で行った。 1. アダルト マウス耳皮膚コレクション 密閉室内の二酸化炭素 (CO2) 暴露による成体を安楽死させるし、頚部転位による安楽死を確認します。注: 実験安楽死法の国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従った。 ベースから?…

Representative Results

成体マウス後部耳介皮膚 (図 1 a)、前耳介皮膚 (図 1 b) が αSMA (赤), Tuj1 (緑)、抗体 immunostained と PECAM-1 (青)。後部の皮膚だった CD11b (赤) と MBP (緑)、Tuj1 (青) と (図 2 a) に対する抗体を用いた神経免疫分布を研究する immunostained です。CD11b の分布+単一セルの解像度 (図 2 b) で…

Discussion

このプロトコルでは、大人の耳の皮膚神経血管構造と免疫細胞分布の分析のための全体マウント immunonohistochemical イメージングについて説明します。このメソッドは分岐の形態形成と末梢神経や血管のパターンだけでなく、免疫細胞と髪を含む皮膚成分の三次元分布を研究する研究者のための多くの実験的利点と考えています卵胞。さらに定量分析のためのイメージング ソフトウェアを使用?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

室管理ありがとう k. ギル、テクニカル サポート、j. ホーキンスとスタッフの国立機関の健康 (NIH) マウス ・ r ・ リードとの援助のための 50 の動物実験施設と行政支援のため f. Baldrey を構築します。その耳は解剖のプロトコルを皮膚、編集のヘルプ、および幹細胞研究室のメンバーのため N. やけどや技術的なヘルプと思慮深い議論の神経血管生物学を共有するための s. 茂木と m. Udey にも感謝。拓山崎は、科学振興 (JSPS) NIH 海徳の日本社会によって支えられました。この作品は、国立心臓、肺、血液研究所 (y. m. に HL005702-11) の学内研究プログラムによって支えられました。

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

Referencias

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Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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