Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

Wanneer B cellen binden aan gepolariseerde arrays van antigenen (bijvoorbeeldweergegeven op het oppervlak van het antigeen-presenteren cellen (APCs)), de resulterende B-cel receptor (BHG) signalering stations de vorming van een klassieke immuun synapse structuur die werd voor het eerst beschreven in T cellen^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13}. Aanvankelijk, microclusters van antigeen-gebonden vorm van de BCRs aan de rand van de B-cel: APC contact site. Deze microclusters wordt vervolgens verplaatst naar het midden van de antigeen contact site, waar ze in een centrale supramoleculaire activering cluster (cSMAC samensmelten) de kern van de immuun SYNAPS vormt. Immuun synapse formatie optimaliseert BHG signalering en faciliteert het BCR-gemedieerde antigeen extractie van de APC membraan¹⁴. Deze overname van antigeen, die wordt gevolgd door antigeen BCR-gemedieerde internalisering en latere antigeen processing, kunt B cellen te presenteren peptide: MHC II complexen naar T-cellen en T-cel help¹⁴uitlokken. Omdat immuun synapse formatie B cel activatie bevordert, ophelderen van de mechanismen die stellen dat dit functionele patroon van receptor organisatie kan bieden nieuwe zijn inzichten in hoe humorale immuunreacties gestart en wordt geregeld.

Reorganisatie van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons is essentieel voor immuun synapse formatie. Gelokaliseerde BHG signalering gestimuleerd door een ruimtelijk-gepolariseerde scala aan antigenen induceert snelle en dramatische remodelleren van de actine cytoskelet^1,15. De vorming van dendritische actine structuren aan de rand van de B-cel oefent duwen krachten op het plasma-membraan en bevordert de verspreiding van de B-cel. Dit maakt de B-cel voor het scannen van een grotere ruimte van de antigeen-steunvlak, en verhoogt het aantal BCRs dat antigeen te binden en te activeren BHG signalering trajecten. Op hetzelfde moment zijn de MTOC en het netwerk van microtubuli omgebogen naar de site van antigeen contact. Als de MTOC de contact site van antigeen nadert, uitbreiden microtubuli die afkomstig zijn van de MTOC langs de binnenzijde van het plasma-membraan op het raakvlak tussen de B-cel en de antigeen-dragende oppervlak^16,17 Deze juxtamembrane microtubuli kunnen vervolgens fungeren als tracks voor de dynein-gemedieerde centripetale beweging van antigeen-gebonden BHG microclusters¹⁸, wat leidt tot de vorming van een cSMAC.

De heroriëntatie en polarisatie van de MTOC naar de immuun SYNAPS vereist intact actine en microtubulus cytoskeletons en hangt vaak af van interacties tussen de corticale actine netwerk en microtubuli^{16,17, 19,20}. Corticale actine-bindende eiwitten, zoals IQGAP1, kunnen het vangen van microtubuli door interactie met eiwitcomplexen dat de microtubulus plus-ends^{21 versieren}. Deze dynamische complexen van plus-end bindende proteïnen bevatten EB1 en CLIP-170, die gezamenlijk worden aangeduid als microtubulus plus-einde bijhouden van eiwitten (+ TIPs)^21,22. + TIPs aan de uiteinden van de microtubuli kunnen binden aan eiwitten die gekoppeld aan het plasma-membraan of de corticale actine cytoskelet zijn. Hierdoor treden genererende mechanismen (bijvoorbeeldhet min-uiteinde gericht verkeer van dynein cortically-verankerd langs de microtubuli) te oefenen trekken krachten op de microtubuli, en daarmee de MTOC verplaatsen. CLIP-170 kan binden aan de steigers actine-geassocieerde proteïne IQGAP1²³, en we hebben aangetoond dat zowel van deze proteïnen vereist voor het BCR-geïnduceerde MTOC polarisatie richting de immuun synapse^{17 zijn}. Deze IQGAP1-CLIP-170 interactie kan een belangrijke rol bij de coördinatie van de verbouwing van het cytoskelet actine met de herpositionering van het netwerk van microtubuli in de B-cel immuun synaps.

Conventionele fluorescentie microscopie is gebleken dat de dramatische reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens de B-cel immuun synapse formatie². Echter, deze aanpak niet het oplossen van kleine cellulaire structuren in detail toe te schrijven aan de limiet van de diffractie van licht, die, volgens Abbe de wet, afhankelijk van de golflengte van licht bestemd is tot verlichting van het monster en de opening van de objectieve²⁴. Deze limiet diffractie Hiermee beperkt u de resolutie van conventionele lichte microscopen 200-300 nm in de laterale richting te 500-700 nm in de axiale richting²⁵. Daarom, kleinere subcellular structuren, evenals de fijne details van de actine en microtubulus-cytoskeletons, kunnen alleen worden waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie. Elektronenmicroscopie beeldvorming van het cytoskelet is tijdrovend, harde monster fixatie en voorbereiding protocollen die biologische structuren kunnen veranderen, en is beperkt tot de antilichaam-gemedieerde detectie vereist. Het vermogen om immunokleuring en gelijktijdig afbeelding meerdere eiwitten of cellulaire structuren is een aanzienlijk voordeel van fluorescentie microscopie. Anderzijds uiting van fluorescerende fusion eiwitten in cellen kunt real-time imaging en is nuttig wanneer daadwerkelijke antilichamen voor immunokleuring de proteïne van belang niet beschikbaar zijn.

Recente technologische vooruitgang in super resolutie microscopie overwinnen van de grenzen van de diffractie van licht en de visualisatie van nanoschaal cellulaire structuren²⁴toegestaan. Een dergelijke super resolutie microscopie techniek heet gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie. STED maakt gebruik van twee lasers, waar een laser prikkelt de fluorophore en een tweede laser met een donut-vormige patroon selectief onderdrukt de fluorescentie emissie rond de fluorophore. Dit vermindert de punt-spread-functie (schijnbare gebied) van een één fluorescerende deeltje en zorgt voor een sub diffractie limiet fluorescerende afbeelding^25,26. Grondtoestand uitputting microscopie hanteert ook fluorescentie gebaseerde technieken te verwerven Super resolutiebeelden. De afbeelding verwerving en wederopbouw tijden zijn lang, er zijn echter slechts een beperkt aantal fluorophores die kunnen worden gebruikt, en de gelijktijdige high-resolution beeldvorming van meerdere cytoskeletal onderdelen is technisch uitdagend omdat handhaving actine en microtubulus structuren vereist verschillende fixatie procedures. Daarom STED heeft meerdere voordelen ten opzichte van elektronenmicroscopie en andere super resolutie microscopie nadert dat het biedt snelle Beeldacquisitie post-processing minimumvereisten heeft en maakt gebruik van de dezelfde fluorophores en kleuring technieken die worden gebruikt voor conventionele fluorescentie microscopie van vaste monsters²⁶.

Nu al super resolutie microscopie hanteert voor het visualiseren van actine structuren in de immuun SYNAPS in natural killer (NK) cellen en T cellen^{26,27,28,29,30, 31}. echter super resolutie beeldvorming van het cytoskelet van de microtubuli, alsmede de gecoördineerde reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens immuun synaps formatie, is slechts onlangs gemelde¹⁷. Wij STED microscopie gewend in afbeelding B-cellen die verspreid over coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antilichamen, die stimuleren BHG signalering en initiëren cytoskelet reorganisatie had gekregen. Bij het uitplaten op geïmmobiliseerdet anti-Ig antilichamen, ondergaan B-cellen dramatische actine-afhankelijke verspreiden, die de eerste gebeurtenissen recapituleert tijdens immuun synapse formatie. Bovenal bleek STED microscopie de fijne details van de dendritische ring van F-actine die vormen aan de rand van het immuunsysteem synapsen en toonde aan dat de MTOC, evenals de microtubuli die eraan verbonden zijn, dicht bij de antigeen contact site¹⁷was verhuisd. Deze microtubuli uitgebreid naar buiten naar de perifere ring van F-actine. Bovendien Multi-Color STED beeldvorming van verschillende combinaties van F-actine, tubuline, IQGAP1, en GFP-gelabeld CLIP-170 + TIPs toonden dat microtubulus plus-ends gekenmerkt door CLIP-170-GFP nauw verbonden met de perifere actine gevlochten en met IQGAP1, een corticale opname eiwitten¹⁷.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor imaging-de actine en microtubulus cytoskeletons in de immuun Synaps met behulp van microscopie STED. Deze methoden zijn geoptimaliseerd met behulp van de A20 lymfkliertest B-cel-lijn, die veel heeft gewerkt voor de studie BHG signalering en immuun synapse formatie^{17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39}. omdat commerciële antilichamen tegen CLIP-170 niet goed voor immunokleuring in eerdere experimenten werkte, we beschrijven in detail de uitdrukking van GFP-gelabeld CLIP-170 op de A20 cellen, samen met de protocollen voor het visualiseren van gelijktijdig maximaal kleuring drie cytoskeletal componenten of cytoskelet-geassocieerde eiwitten. Methoden voor het gebruik van STED microscopie naar afbeelding actine op NK-cel immuun synapsen zijn⁴⁰eerder is beschreven. Hier, breiden we dit aan het verwerven van Multi-Color Super resolutiebeelden van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons in B cellen.

Een belangrijke overweging voor super-resolutie microscopie is met behulp van de juiste fixatie-procedures voor het onderhouden van cellulaire structuren en voorkomen van schade aan fluorescerende eiwitten. De fixatie en kleuring van de hier vermelde methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden GFP fluorescentie en hoge resolutie beeldvorming van de actine- en microtubulus-netwerken. Wanneer het uiten van fluorescente proteïnen, opgemerkt moet worden dat B-cellen meestal moeilijk zijn te transfect. Met behulp van dit protocol, 20-50% van de A20 express cellen meestal de transfected GFP fusieproteïne, en onder deze populatie de hoeveelheid eiwit expressie variabel. Niettemin, super resolutie beeldvorming van actine en microtubuli met behulp van de procedures die we beschrijven is heel robuust en afbeeldingen van hoge kwaliteit zijn gemakkelijk verkregen. Ondanks hun kleine formaat ten opzichte van de A20 cellen, laten we zien dat deze procedures kunnen ook worden gebruikt om het imago van het netwerk van microtubuli in primaire B-cellen die kort zijn geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS). We hebben aangetoond dat de LPS-geactiveerde primaire B cellen kunnen zijn transfected met siRNAs op relatief hoge rendement (dat wil zeggen, zodanig dat eiwit uitputting kan worden gedetecteerd door immunoblotting), waardoor ze een goed alternatief voor het gebruik van B cellijnen voor sommige studies ¹⁷.