Summary

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Published: May 08, 2018
doi:

Summary

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Abstract

Hematopoetik kök hücre (HSC) genesis embriyonik gelişim sırasında çalışma özelliği erken embriyo HSC öncüleri nadir ve işlevsel olarak uzun vadeli multilineage engraftment potansiyelini belirlemek deneyleri eksikliği ile sınırlı bireysel sözde HSC öncüleri. Burada, yalıtım ve işlevsel olarak doğrulanmış HSC öncüleri tek hücre düzeyinde karakterizasyonu sağlar metodoloji açıklayın. İlk olarak, biz kesin fenotipik parametresi, tek tek sıralanmış her hücrenin katalog için dizin sıralama kullanmak deneysel analizi için ek işaretçileri olan HSC öncüleri için zenginleştirmek için fenotipik işaretçileri kullanarak. İkinci olarak, her dizin sıralanır hücre vasküler niş stroma sigara engrafting HSC öncüleri multilineage, uzun vadeli engraftment içinde potansiyel ile fonksiyonel HSC için olgunlaşma destekler aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölge ile ortak kültürlü. nakli deneyleri. Bu metodoloji korelasyon klonal hemogenic öncüleri ile fonksiyonel engraftment potansiyellerini fenotipik özellikleri veya transkripsiyon profil, HSC habercisi ayrıntılı bir analiz için bir araç sağlayan gibi diğer özellikleri sağlar tek hücre düzeyinde geliştirme.

Introduction

Klonal çalışmalar heterojenite yetişkin HSCs, yaşlanma1sırasında HSC alt türlerini ve HSC davranış değişiklikleri yeni bilgi sağlayan uzun vadeli engraftment özelliklerini ortaya koymuştur. Ancak, embriyonik HSCs benzer çalışmaları ve onların öncüleri daha zor olmuştur. Erken embriyonik gelişim sırasında geçici bir süreç içinde hemogenic endotel anılacaktır olarak bilinen öncüleri nüfusu HSCs kaynaklanan olarak endotel hematopoetik geçiş2. Sağlam, uzun vadeli multilineage engraftment şartına yetişkin alıcılar nakli takip sağlamak için onların yetenek tarafından tanımlanan ilk HSC değil embriyonik günün ardından kadar 10.5 (E10.5) fare embriyo çok düşük frekanslı3, tespit . Gelişimleri sırasında öncüleri hemogenic endotel doğan HSC (pre-HSC) için olgunlaşma nakli deneyleri4,5 verimli engraftment için izin yetişkin HSC özelliklerini edinme önce geçmeleri gerekir , 6. nadir HSC kökenli, hematopoetik ataları ile erythroid, çok sayıda çalışmanın engellemeyecek myeloid ve lenfoid potansiyeli zaten algılanır HSC ortaya çıkması pre-HSC7,8önce. Böylece, pre-HSC diğer hematopoetik ataları ayırt clonally hücreleri izole etmek ve onları kendi olgunlaşma için yeterli sinyallerle HSC nakli deneyleri engraftment özelliklerini tespit etmek, sağlamak için yöntemler gerektirir.

Yaklaşımlar bir dizi tarafından ex vivo veya vivo olgunlaşma HSC için pre-HSC tespiti için izin olan tarif edilmiştir. Ex vivo yöntemler kültür nerede ilk HSC geliştirme9‘ tespit AGM bölge gibi embriyonik dokuların bağlıydı. Bu yöntemler, ayrılma, dahil protokolleri bina sıralama ve AGM dokuların yeniden toplama sıralanmış nüfus içinde para aort E11.5 için E9.5 üzerinden geliştirme sırasında HSC öncüleri içeren karakterizasyonu izin splanchnopleura (P-Sp) / AGM bölgeleri4,5,10; Ancak, bu yaklaşımların öncüleri klonal analiz için gerekli tek hücre düzeyinde yüksek üretilen iş analizi için mükellef değildir. Microenvironment HSC öncüleri, daha önceki aşamalarında destek için daha uygun olduğu kabul edilir nerede benzer şekilde, in vivo olgunlaşma yeni doğmuş fare, içine nakli tarafından da sarısı sac ve AGM sıralanmış nüfus çalışmaları sağladı / P-Sp (P-Sp habercisi AGM için bölgedir) pre-HSC, ama bu yöntemleri özellikleri ile de tek için sağlam bir platform sağlamak için başarısız hücre analizi11,12.

Rafii ve ark. çalışmalardan o Akt aktive endotel hücre (EC) stroma bir niş substrat yetişkin HSC kendini yenileme vitro13,14,15desteği sağlayabilir gösterdi. Biz son zamanlarda Akt aktif EC AGM bölgesinden (AGM-EC) elde edilen hemogenic öncüleri, gibi erken E9 geliştirme, HSC, Yetişkin engrafting için hem de sonraki izole olgunlaşma için uygun vitro niş sağlar tespit kendini yenileme oluşturulan HSC16. Bu sistemi basit bir 2-boyutlu ortak kültür istihdam olduğunu göz önüne alındığında, tek tek izole hemogenic öncüleri HSC potansiyelini klonal analiz için kolayca uyarlanabilir.

Son zamanlarda bir yaklaşım bireysel hemogenic öncüleri AGM-AB ortak kültür ve sonraki fonksiyonel analiz Ekiminde fare embriyo gelen dizin sıralanması birleştirerek klonal hemogenic öncüleri HSC potansiyelini tahlil bildirdin 17deneyleri. Dizin sıralama olduğunu Floresans aktif bir mod hücre (FACS) bu kayıtları (dizinler) sıralama her tek tek sıralanmış hücre böyle fenotipik parametreleri (Yani, ileri dağılım (FSC-A), yan dağılım (SSC-A), floresan parametreleri) tüm bu özellikleri geriye dönük olarak sıralama takip sonraki fonksiyonel analiz için ilişkili olabilir. FACS yazılım her hücre ve pozisyonu/kuyunun yerleştirildiği 96-şey plaka için her iki fenotipik bilgileri kaydeder. Bu teknik daha önce zarif kullanılmış olan yetişkin HSC heterojenite tanımlamak, daha fazla HSC uzun vadeli engrafting alt için zenginleştirmek ve fenotipik HSC parametrelerinin transkripsiyon ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir fenotipik parametreleri belirlemek için özellikleri tek düzey18,19hücre. Burada, benzersiz fenotipik parametreleri tanımlaması ve pre-HSC katkılarıyla lineage embriyonik gelişme erken aşamalarında sağlar bu yaklaşımın detaylı metodoloji sağlamak.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi tarafından onaylanmıştır. 1. ortak kültür için AGM-EC Monolayers hazırlanması 24 saat önce AGM diseksiyon ve sıralama, AGM-EC kültür medya ve filtre sterilize yapmak. 96-şey plaka her şey için su (100 µL/de) % 0,1 jelatin ekleyin ve 15 dk. aspiratı jelatin için oda sıcaklığında kuluçkaya ve plaka bir doku kültürü mahalled…

Representative Results

Şekil 1A bir şematik deneysel tasarım gösterir. P-Sp/AGM doku disseke, havuza alınmış ve collagenase içinde ayrışmış sonra dizin sıralama için antikorlar VE-Cadherin ve EPCR ile lekeli. Pre-HSC VE-Cadherin+EPCRyüksek (şekil 1B) göre hücrelerdeki zenginleştirilmiş. Diğer fluorochrome Birleşik antikorlar geriye dönük olarak her hücre için dizin sıralama sırasında kaydedilir ek feno…

Discussion

HSC genesis embriyonik gelişim sırasında çalışmanın HSC potansiyel henüz transplante yetişkin alıcılar uzun vadeli multilineage hematopoetik rekonstitüsyon sağlamak için yetki eksik hemogenic öncüleri olarak algılamak için araç gerektirir. Bu protokol için biz embriyonik hemogenic öncüleri klonal bir tahlil vasküler niş ECs stromal ortak kültür tarafından öncüleri HSC için olgunlaşma destekler, AGM fonksiyonel analizde sonraki nakli deneyleri ile mevcut. Dizin izinleri sıralama birleşmesi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fred Hutchinson Akış Sitometresi temel yardım için FACS ile Andrew Berger, Stacey Dozono ve Brian Raden teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yardımcı işbirlikçi Grant #HL099997 ve NIDDK #RC2DK114777 vermek #HL100395, ulusal kurumları sağlık NHLBI UO1 grant tarafından desteklenmiştir. Brandon Hadland Alex’in limonata standı Vakfı ve Hyundai umut üzerinde tekerlekler Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Materials

AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

Referencias

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Play Video

Citar este artículo
Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

View Video