Estudios clonales han revelado heterogeneidad en las propiedades a largo plazo del engraftment de adultos HSCs, proporcionar la nueva penetración en subtipos de HSC y cambios en el comportamiento HSC durante envejecimiento¹. Sin embargo, estudios similares de HSCs embrionarias y sus precursores han sido más difícil. Durante el desarrollo embrionario temprano, HSCs surgen de una población de precursores conocido como endotelio hemogenic en un proceso transitorio que se refiere como endoteliales hematopoyético transición². El primer HSC, definido por su capacidad para proporcionar engraftment del multilineage robusto, a largo plazo después del trasplante en recipientes adultos condicionados, no se detectan hasta después del día embrionario 10.5 (E10.5) en el embrión murino, en muy baja frecuencia³ . Durante su desarrollo, precursores de HSC (pre-HSC) derivados de endotelio hemogenic deben sufrir maduración antes de adquirir las propiedades de HSC adultos que permiten la eficiente injerto en trasplante ensayos^{4,5 , 6}. oscurecimiento el estudio del origen HSC rara, una multitud de progenitores hematopoyéticos con eritroides, potencial mieloide y linfoide ya se detectan antes de la aparición de HSC de pre-HSC^7,8. Así, la distinción pre-HSC de otros progenitores hematopoyéticos exige métodos clonally aislar células y les proporcione las señales suficientes para su maduración a HSC, para detectar sus propiedades engraftment en los ensayos de trasplante.

Ha descrito una serie de enfoques que permiten la detección de pre-HSC por maduración en vivo o ex vivo a HSC. Métodos ex vivo han dependido de la cultura de los tejidos embrionarios, como la región AGM, donde el primer HSC se detectan en el desarrollo⁹. Basándose en estos métodos, protocolos que incorporan la disociación, clasificación y la agregación de tejidos AGM han permitido la caracterización de poblaciones ordenadas que contienen precursores HSC durante el desarrollo de E9.5 en E11.5 en los para-aórticos Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiones^4,5,10; sin embargo, estos planteamientos no son susceptibles de análisis de alto rendimiento de precursores a nivel unicelular para análisis clonal. Del mismo modo, en vivo la maduración de transplante en ratones recién nacidos, donde el microambiente se presume que es más conveniente para el apoyo de las anteriores etapas de precursores HSC, ha permitido estudios de poblaciones ordenadas desde el saco vitelino y AGM / P-Sp (P-Sp es la región del precursor a la AGM) con características de pre-HSC, pero estos métodos también proporcionan una sólida plataforma para el solo, no de la célula análisis^11,12.

Estudios de Rafii et al demostraron que estroma Akt activa la célula endotelial (CE) puede proporcionar un substrato de nicho para el apoyo de adultos HSC auto-renovación en vitro^13,14,15. Recientemente se determinó que Akt activa CE derivada de la región AGM (AGM-CE) proporciona un nicho adecuado en vitro para la maduración de precursores hemogenic, aislado desde E9 en desarrollo, a HSC engrafting adulto, así como la posterior auto renovación de HSC generado¹⁶. Dado que este sistema emplea una simple cultura de CO 2-dimensional, es fácilmente adaptable para análisis clonal del potencial HSC de precursores hemogenic individualmente aislados.

Recientemente hemos reportado un acercamiento al análisis del potencial HSC de precursores hemogenic clonal combinando índice clasificación de individuales hemogenic precursores de embriones murinos con cocultivo AGM-CE y posterior análisis funcional en el trasplante ensayos de¹⁷. Índice de clasificación es un modo de activar la fluorescencia de la célula clasificación (FACS) que registra (índices) todos parámetros fenotípicos (es decir, parámetros de fluorescencia de forward scatter (FSC-A), lado scatter (SSC-A),) de cada célula individual ordenado tal que estos características pueden correlacionarse retrospectivo para posterior análisis funcional tras la clasificación. Software de FACS registra tanto información fenotípica cada celda y la posición/de la placa de 96 pozos en que se colocó. Esta técnica se ha utilizado anteriormente con elegancia para identificar heterogeneidad en HSC adultos, determinar parámetros fenotípicos que más enriquecen para el subconjunto engrafting a largo plazo de HSC y correlacionan los parámetros fenotípicos de HSC con transcripcional propiedades a la sola célula nivel^18,19. Aquí, ofrecemos una metodología detallada de este enfoque que permite la identificación de parámetros fenotípicos únicos y las contribuciones de linaje de pre-HSC durante etapas tempranas del desarrollo embrionario.