Клональный анализ прекурсоров эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток с использованием индекса одну ячейку Сортировка в сочетании с эндотелиальных клеток нишу Сопредседатель культуры
Summary
Здесь мы представляем методологии клоновых анализа прекурсоров гемопоэтических стволовых клеток во время мышиных эмбрионального развития. Мы объединяем индекс сортировки клеток одного из эмбриональных аорто Гонада мезонефрос региона с совместного культуры эндотелиальных клеток и трансплантации характеризовать фенотипических свойств и приживления потенциал одного кроветворных прекурсоров.
Abstract
Возможность изучить генезис гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во время эмбрионального развития было ограничено отсутствием анализов, которые функционально определить долгосрочный потенциал мультилинейного приживления и редкость HSC прекурсоров в раннего эмбриона Индивидуальные предполагаемого HSC прекурсоров. Здесь мы описываем методологии, которая позволяет изоляции и характеристика функционально проверенных HSC прекурсоров на уровне отдельной ячейки. Во-первых мы используем индекс сортировки в каталог точные фенотипического параметра каждой индивидуально отсортированных ячейки, используя комбинацию фенотипические маркеры для обогащения HSC прекурсоров с дополнительные маркеры для экспериментального анализа. Во-вторых каждый индекс сортировка клеток совместно культивируемых с сосудистой нишу стромы аорто Гонада мезонефрос (AGM) региона, который поддерживает созревания-отлаживание HSC прекурсоров для функциональных HSC с мультилинейного, долгосрочные приживления потенциал в Трансплантация анализов. Эта методология позволяет корреляции фенотипических свойств клоновых кроветворения прекурсоров с потенциалом их функциональной приживления или другие свойства, такие как транскрипционный анализ профиля, предоставляя средства для детального анализа прекурсоров HSC Разработка на уровне отдельной ячейки.
Introduction
Клоновых исследования показали гетерогенность в свойствах долгосрочный приживления взрослых СКК, обеспечивая новое понимание HSC подтипы и изменения в поведении HSC во время старения1. Однако подобные исследования эмбриональных СКК и их прекурсоров были более сложным. Во время раннего эмбрионального развития, СКК возникают от населения прекурсоров, известный как эндотелий кроветворения в рамках переходного процесса, упоминаемые как эндотелиальные гемопоэтических перехода2. Первый HSC, определяется их способности предоставлять надежную и долговременную мультилинейного приживления, после трансплантации в кондиционированном взрослых получателей, не обнаруживаются до тех пор пока после эмбриональных дня 10.5 (E10.5) в мышиных эмбрионов, в очень низкой частоты3 . Во время их разработки прекурсоры HSC (pre-HSC) вытекающие из эндотелия кроветворения, должны пройти созревания до получения свойства взрослых HSC, которые позволяют эффективно приживления в трансплантации анализов4,5 , 6. заслоняя исследования редких HSC происхождения, множество гемопоэтических прародителями с эритроидные, миелоидной и лимфоидных потенциал уже обнаружено до появления HSC от pre-HSC7,8. Таким образом отличающие pre-HSC от других гемопоэтических прародителями требует методов клонально изолировать клетки и передавать их с сигналами, достаточные для их созревания HSC, чтобы обнаружить их приживления свойства в трансплантации анализов.
Были описаны ряд подходов, которые позволяют для обнаружения pre-HSC, либо ex vivo или в естественных условиях созревания по HSC. Ex vivo методы зависели от культуры эмбриональных тканей, таких как AGM региона, где первый HSC обнаруживаются в развитие9. Опираясь на эти методы, протоколы, которые включают диссоциации, сортировка и повторное агрегирование AGM тканей позволили характеристика отсортированных населения, содержащие HSC прекурсоров во время разработки от E9.5 до E11.5 в пункт аорты splanchnopleura (P-Sp) / AGM регионов4,5,10; Однако эти подходы не поддаются высок объём анализа прекурсоров, необходимых для Клональный анализ на уровне отдельной ячейки. Аналогичным образом, в естественных условиях созревание трансплантации в новорожденных мышей, где микроокружения считается более подходящим для поддержки более ранних этапов HSC прекурсоров, позволил также исследования отсортированных населения из желточного мешка и AGM / P-Sp (P-Sp является предшественником региона AGM) с характеристиками pre-HSC, но эти методы также не сумеют обеспечить надежную платформу для одной ячейки анализ11,12.
Исследования из Rafii et al. продемонстрировал, что стромы Akt активированный эндотелиальных клеток (EC) может обеспечить нишу субстрат для поддержки взрослых следственный HSC самообновления в vitro13,14,15. Мы недавно установлено, акт активированный EC, производные от региона AGM (AGM-EC) обеспечивает подходит в vitro нишу для созревания кроветворения прекурсоров, как E9 в развитии, для взрослых отлаживание HSC, а также последующие изолированные самообновлению сгенерированный HSC16. Учитывая, что эта система использует простой 2-мерной Сопредседатель культуры, он легко адаптируется для Клональный анализ потенциала HSC индивидуально изолированных кроветворения прекурсоров.
Недавно мы сообщили подход к assay HSC потенциал клоновых кроветворения прекурсоров путем объединения индекс сортировки отдельных кроветворения прекурсоров из мышиных эмбрионов с AGM-EC Сопредседатель культуры и последующих функционального анализа в трансплантации assays17. Индекс сортировки является режим активирован флуоресценции клеток сортируя (FACS), записей (индексы) все фенотипические параметры (то есть, вперед точечной (FSC-A), стороны точечной (SSC-A), флуоресценции параметры) каждого индивидуально сортировки клеток что эти функции можно ретроспективно коррелирует с последующим функционального анализа после сортировки. СУИМ программное обеспечение записи оба фенотипические информацию для каждой ячейки и положение/колодец 96-луночных пластины, в которую он был помещен. Этот метод ранее элегантно используется для выявления неоднородности в взрослых HSC, определить фенотипические параметры дальнейшего обогащения для долгосрочного голокоренные подмножества HSC, которые коррелируют с транскрипционный анализ фенотипических параметры HSC свойства в одной ячейке уровня18,19. Здесь мы предоставляем подробные методологии этого подхода, который позволяет идентификации уникальных параметров фенотипических и происхождение взносов pre-HSC ранних этапах эмбрионального развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение генезиса HSC во время эмбрионального развития требует средства для выявления потенциальных прекурсоров кроветворения, еще не хватает компетенции предоставлять долгосрочные мультилинейного кроветворные воссоздания в трансплантированы взрослых получателей HSC. В этом протоко…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Эндрю Бергер, Стейси Dozono и Брайан Раден в Фреда Хатчинсона потока Cytometry ядро для помощи с СУИМ. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения NHLBI UO1 Грант #HL100395, вспомогательные совместный грант #HL099997 и NIDDK Грант #RC2DK114777. Брэндон Хадланд поддерживается в Лимонад Стенд Фонд Алекс и Hyundai надежды на фундаменте колеса.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Referencias
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
