تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك
Summary
نقدم هنا منهجية لتحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية المكونة للدم أثناء التطور الجنيني مورين. أن نجمع بين مؤشر فرز الخلايا المفردة من منطقة الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس الجنينية مع خلية غشائي ثقافة المشارك وزرع لتوصيف الخصائص المظهرية وإمكانات engraftment السلائف المكونة للدم واحد.
Abstract
وقد حدت القدرة على دراسة نشأة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) أثناء التطور الجنيني ندرة HSC السلائف في الجنين المبكر وعدم وجود فحوصات وظيفيا تحديد إمكانات طويلة الأجل انجرافتمينت مولتيلينيجي الفردية السلائف HSC المفترضة. هنا، يمكننا وصف المنهجية التي تمكن من عزل وتوصيف السلائف HSC المصادق عليه وظيفيا على مستوى الخلية الواحدة. أولاً، فنحن نستخدم فهرس الفرز لكتالوج المعلمة المظهرية دقيقة لكل خلية تم فرزها على حدة، باستخدام مزيج من العلامات المظهرية لإثراء للسلائف HSC مع علامات إضافية لتحليل تجريبي. ثانيا، كل خلية فرز الفهرس مثقف يشترك مع ستروما مكانة الأوعية الدموية من المنطقة (AGM) الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس، الذي يدعم النضوج غير انجرافتينج HSC السلائف إلى HSC الوظيفية مع انجرافتمينت مولتيلينيجي وطويلة الأمد المحتملة في فحوصات الزرع. هذه المنهجية يمكن ارتباط الخصائص المظهرية السلائف هيموجينيك الاستنساخ مع إمكاناتها الفنية انجرافتمينت أو خصائص أخرى مثل الشخصية النسخي، توفير وسيلة لتحليل مفصل للسلائف HSC التنمية على مستوى الخلية الواحدة.
Introduction
وقد كشفت الدراسات الاستنساخ التباين في خصائص engraftment الطويلة الأجل هسكس الكبار، توفير نظرة ثاقبة جديدة HSC الأنواع الفرعية والتغييرات في السلوك HSC أثناء الشيخوخة1. ومع ذلك، كانت دراسات مماثلة من هسكس الجنينية وسلائفها أكثر تحديا. تنشأ أثناء التطور الجنيني المبكر، هسكس من سكان السلائف المعروفة بالبطانة هيموجينيك في عملية عابرة المشار إليها بطانية للمرحلة الانتقالية المكونة للدم2. لم يتم الكشف عن HSC الأولى، تعرف بقدرتها على توفير انجرافتمينت مولتيلينيجي قوية وطويلة الأمد بعد زرع الأعضاء إلى المستفيدين الكبار مشروطة، حتى بعد يوم الجنينية 10.5 (E10.5) في الجنين مورين، في الترددات المنخفضة جداً3 . خلال تنميتها، يجب أن يخضع للسلائف إلى HSC (قبل-HSC) الناشئة عن البطانة هيموجينيك النضج قبل الحصول على خصائص HSC الكبار التي تسمح بكفاءة انجرافتمينت في زرع فحوصات4،5 , 6-التعتيم دراسة أصل HSC نادرة، العديد من فروعه المكونة للدم مع محمر، سبق اكتشاف إمكانات النقوي، واللمفاوية قبل ظهور HSC من HSC قبل7،8. وهكذا، التمييز بين ما قبل HSC من فروعه الأخرى المكونة للدم يتطلب أساليب كلونالي عزل الخلايا وتزويدهم بإشارات كافية نضج بهم إلى HSC، للكشف عن خصائصها engraftment في فحوصات الزرع.
وقد وصف عدد من النهج التي تسمح بالكشف عن ما قبل HSC بنضج السابقين فيفو أو في فيفو إلى HSC. السابقين فيفو أساليب تعتمد على ثقافة أنسجة الجنينية، مثل منطقة الجمعية العمومية، حيث يتم الكشف عن HSC الأولى في التنمية9. بناء على هذه الأساليب، البروتوكولات التي تدرج في الانفصال، الفرز، وإعادة تجميع الأنسجة AGM سمحت توصيف السكان تم فرزها تحتوي على السلائف HSC أثناء التطوير من E9.5 إلى E11.5 في الفقرة-الابهري سبلانتشنوبليورا (فس)/AGM المناطق4،،من510؛ ومع ذلك، هذه النهج غير قابلة للتحليل الفائق من السلائف على مستوى الخلية الوحيدة المطلوبة لتحليل الاستنساخ. وبالمثل، في فيفو النضوج بزرع في الفئران حديثي الولادة، حيث المكروية يفترض أن يكون أكثر مناسبة لدعم المراحل المبكرة من السلائف HSC، كما مكن دراسات للسكان تم فرزها من كيس ألمح والجمعية العمومية/ ف س (س ف هو منطقة السلائف إلى العمومية) مع خصائص HSC السابقة، ولكن هذه الأساليب أيضا تفشل في توفير منصة قوية لواحد خلية تحليل11،12.
وأظهرت دراسات من رافي وآخرون ستروما Akt تنشيط الخلية غشائي (الجماعة الأوروبية) التي يمكن أن توفر الركازة متخصصة لدعم الكبار HSC الذاتي تجديد في المختبر13،،من1415. قررنا مؤخرا أن EC تنشيط Akt المستمدة من منطقة الجمعية العمومية (AGM-الاتحاد الأوروبي) يوفر مكانة مناسبة في المختبر لنضوج السلائف هيموجينيك، معزولة في أقرب وقت E9 في التنمية، إلى HSC انجرافتينج الكبار، فضلا عن اللاحقة الذاتي تجديد ولدت HSC16. ونظرا لأن هذا النظام يستخدم ثقافة المشارك 2-الأبعاد بسيطة، أنها القابلة للتكييف وفقا لتحليل الاستنساخ من إمكانات HSC السلائف هيموجينيك فردية منعزلة.
ونحن قد أبلغت مؤخرا نهجاً للاعتداء إمكانات HSC السلائف هيموجينيك الاستنساخ عن طريق الجمع بين فهرس الفرز السلائف هيموجينيك الفردية من الأجنة موريني مع ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية والتحليل الوظيفي اللاحقة في زرع فحوصات17. فهرس الفرز هو طريقة لتنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تلك السجلات (فهارس) كافة المعلمات المظهرية (أيمبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ)، الجانب مبعثر (SSC-أ)، الفلورية المعلمات) لكل خلية تم فرزها على حدة مثل هذه أن هذه يمكن الربط بين ميزات أثر رجعي للتحليل الوظيفي اللاحقة بعد الفرز. برنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية السجلات كل المعلومات المظهرية لكل خلية والموقف/بئر لوحة 96-البئر الذي تم وضعه. هذا الأسلوب قد استخدم أناقة سابقا لتحديد عدم التجانس في HSC الكبار، وتحديد المعلمات المظهرية زيادة إثراء لمجموعة فرعية انجرافتينج طويلة الأجل من HSC، والربط بين معلمات المظهرية من HSC النسخي خصائص في الوحيدة الخلية مستوى18،19. هنا، نحن نقدم منهجية مفصلة لهذا النهج التي تمكن من تحديد المعلمات المظهرية فريدة من نوعها، ونسب الاشتراكات من قبل-HSC خلال المراحل الأولى من التنمية الجنينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة نشأة HSC أثناء التطور الجنيني يتطلب وسائل للكشف عن HSC المحتملة في السلائف هيموجينيك حتى الآن تفتقر إلى اختصاص لتوفير إعادة تشكيل المكونة للدم مولتيلينيجي طويلة الأجل في زرع المستفيدين الكبار. في هذا البروتوكول، نقدم مقايسة الاستنساخ السلائف هيموجينيك الجنينية stromal ثقافة المشارك في ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر بيرغر أندرو، دوزونو ستايسي ورادين ريان في فريد هتشينسون التدفق الخلوي نواة للمساعدة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. وأيد هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة نهلبي UO1 #HL100395، تبعية #HL099997 منحة التعاونية، ونيدك منحة #RC2DK114777. براندون هادلاند معتمد من قبل مؤسسة الوقوف عصير الليمون أليكس والأمل هيونداي في “مؤسسة العجلات”.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Referencias
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
