Summary

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

Published: November 06, 2017
doi:

Summary

Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.

Abstract

Wir beschreiben eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur, eine physisch resistent Gewebe mit einem hohen Gehalt von Strukturproteinen. Sezierten Gliedmaßen Muskeln von Erwachsenen Mäusen sind physisch durch mechanische Homogenisierung oder eine Kombination von hacken und Douncing in einem hypotonischen Puffer vor Formaldehyd Fixierung der Zelle lysate gestört. Die feste Kerne werden gereinigt, durch weitere Zyklen von mechanischer Homogenisierung oder Douncing und sequentielle Filtrationen, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Die gereinigte Kerne können sofort oder zu einem späteren Zeitpunkt nach dem Einfrieren beschallt werden. Das Chromatin kann effizient beschallt und ist geeignet für Chromatin Immunopräzipitation Experimente, wie durch die Profile für Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon Änderungen erhalten. Die verbindliche Ereignisse mit Chromatin vorbereitet durch dieses Protokoll nachgewiesen sind überwiegend in die Muskelfaser Kerne trotz der Anwesenheit von Chromatin von anderen Faser-assoziierten Satelliten- und Endothelzellen stattfindet. Dieses Protokoll ist daher angepasst, Genregulation in der Skelettmuskulatur erwachsener Mäuse zu studieren.

Introduction

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gekoppelt und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-Seq) geworden, die Methoden der Wahl Transkription zu studieren und epigenetischen Regulation der Genexpression in verschiedenen Geweben und Zelltypen1. Diese Technik erlaubt es genomweiten Profilierung der kovalente Chromatin Änderungen, Histon Variante Belegung und Transkription Faktor Bindung2,3.

ChIP von kultivierten Zellen gut etabliert ist, bleibt ChIP von Säugetier-Gewebe schwieriger. Die Vorbereitung von Chromatin für ChIP umfasst mehrere wichtige Schritte, die für jede Art von Gewebe und Zellen optimiert werden müssen. Chromatin kann aus der zellulären Lysates kultivierten Zellen oder folgende Reinigung des ihre Kerne hergestellt werden. Im Falle von Säugetier-Gewebe sind effiziente lyse, Formaldehyd Fixierung und Reinigung der Kerne kritisch, um optimale Erholung des Chromatins zu gewährleisten. Darüber hinaus hat die Wahl, ob die Kerne vor oder nach ihrer Reinigung beheben experimentell zu ermitteln. Trotz dieser Hürden hat ChIP aus dem Gewebe wie Leber, Hoden oder Gehirn4,5,6erfolgreich durchgeführt. Im Falle der Skelettmuskulatur ist Störung der physisch resistent Gewebe, die einen hohen Gehalt an Strukturproteinen und Isolation von seinen Kernen Exponate besonders anspruchsvoll. Angesichts dieser Besonderheit, geben Protokolle, optimiert für andere Gewebe nicht zufriedenstellende Ergebnisse für skelettartigen Muskeln.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur ChIP-Grade Chromatin von Maus Skelettmuskelgewebe zu isolieren, die physisch stören das Gewebe, Formaldehyd Fixierung und die Isolation der Kerne und Beschallung beinhaltet. Die Effizienz dieser Methode Chromatin geeignet für ChIP aus diesem Gewebe vorzubereiten zeigte sich durch ChIP-qPCR und ChIP-Seq für verschiedene Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon-Modifikationen-7.

Diese neue Technik ist wesentlich schneller als ein zuvor gemeldeten Protokoll8 bestehend aus lange Kollagenase Verdauung Schritte während dieser Zeit, Änderungen bei genomischen Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren und Veränderungen in der Genexpression erfolgen können. Die Schnelligkeit, mit der die Kerne isoliert und fixiert sind, macht die hier beschriebene Methode besonders attraktiv, Chromatin vorzubereiten, die mehr treu den nativen genomische Belegung Zustand erfasst. Außerdem, obwohl andere Methoden für Chromatin Isolierung oder Protein-Extraktion aus Muskelgewebe haben beschrieben8,9,10 und verwendet wurden für ChIP-qPCR Experimente auf ausgewählte Gene, kein ChIP-seq Daten wurde über sie berichtet. Die Methode hier berichtet eignet sich für Transkription Faktor und Histon Modifikation ChIP-Seq, und daher sollte auch für 3 / 4C oder HiC Chromatin Konformation Erfassung Anwendungen geeignet.

Protocol

Mäuse gehalten wurden, im Einklang mit den institutionellen Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren und nationale Tier-Pflege-Richtlinien (Europäische Kommission Richtlinie 86/609/EWG; Französischen Dekret Nr. 87-848). Alle Verfahren wurden von der französischen nationalen Ethikkommission genehmigt. 1. Isolation von Muskelgewebe Opfer eines Erwachsenen 6 bis 8 Wochen altes Baby Maus durch zervikale Dislokation. Sterlise der Extremität durch Spülen mit 70 % Ethan…

Representative Results

Um die Kerne zu isolieren, führten wir mechanische Homogenisierung des Muskelgewebes seziert und Hackfleisch für entweder 15 oder 45 s, bei 18.000 und 22.000 u/min (siehe Tabelle der Materialien). Unter allen Bedingungen Kerne aus den Trümmern Gewebe getrennt werden könnte, aber die Ausbeute war optimal mit der niedrigeren Drehzahl (Abbildung 1A-B). Kerne könnten auch durch Douncing für 3-5 min (Abb…

Discussion

Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll für die Zubereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskeln und zeigen, dass das Chromatin für ChIP Experimente geeignet ist, die Transkription Faktor Bindung und kovalente Histon-Modifikationen in den Muskelfaser-Kernen zu erkennen. Dieses Protokoll beinhaltet mehrere kritische Schritte. Die erste ist Gewebe Störungen, die durch Dounce oder durch mechanische Scherung erfolgen kann. Mechanische Scherung ist schneller und mehr reproduzierbar, und ist daher die Met…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei allen Mitarbeitern des IGBMC Hochdurchsatz-Sequenzierung Anlage, ein Mitglied des Konsortiums “Frankreich-Génomique” (ANR10-INBS-09-08) und alle IGBMC allgemeine Dienstleistungen insbesondere das Personal der IGBMC Tierhaltung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem CNRS, INSERM, AFM, der Ligue Nationale Contre le Cancer, die französische staatliche Fonds durch die ANR im Rahmen des Programms Investissements Avenir gekennzeichnet ANR-10-IDEX-0002-02, die Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. S.J wurde unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 und V.U durch das Ministère de nannte et De La Recherche. ID ist ein ‘Équipe Labellisée’ der Ligue Nationale Contre le Cancer.

Materials

T 25 digital ULTRA-TURRAX T 18 ULTRA-TURRAX 0009022800
PMSF SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL P7626-25G
Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free Roche Diagnostics 11873580001
Protein G Sepharose beads SIGMA-ALDRICH CHIMIE P-3296
Proteinase K SIGMA-ALDRICH CHIMIE P-2308
Cell Strainers 70um Corning BV 431751
Cell Strainers 40um Corning BV 352340
Formaldehyde EM grade Euromedex 15710-S
Rnase A Fischer Scientific 12091039
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA-ALDRICH CHIMIE P3803
BSA SIGMA-ALDRICH CHIMIE B4287-25G
yeast tRNA SIGMA-ALDRICH CHIMIE R5636
Glycogen Blue AMIBION AM9516
Pol II ChIP Antibody Santa Cruz SC-9001
H3K27ac ChIP Antibody Active Motif 39133
Tead4 ChIP Antibody Aviva Systems Biology (ARP38276_P050)
IGEPAL SIGMA-ALDRICH CHIMIE I-3021
E220 Focused Ultrasonicator Covaris E220
Name Company Catalog Number Comments
Additional items
Scissors
Loose Dounce
15 ml and 50 ml falcon tubes
14 ml round bottom tubes
1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes
70 μm and 40 μm cell strainers (Corning)

Referencias

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Citar este artículo
Joshi, S., Ueberschlag-Pitiot, V., Metzger, D., Davidson, I. Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (129), e56504, doi:10.3791/56504 (2017).

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