פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר
Summary
פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.
Abstract
אנו מתארים פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הכנת כרומטין של שריר השלד העכבר למבוגרים, טישו פיזית עמיד עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי הגפיים ביתור של עכברים בוגרים הן משובשות פיזית על ידי מכני homogenisation, או שילוב של הא ו douncing, במאגר היפוטוניק לפני פורמלדהיד קיבוע של התא lysate. גרעינים קבוע כבר טהור לפי מחזורים נוספים homogenisation מכני, סינון רציפים כדי להסיר שאריות תאים או douncing. גרעינים מטוהרים יכול להיות sonicated באופן מיידי או בשלב מאוחר יותר לאחר הקפאה. יכול להיות sonicated ביעילות כרומטין, הוא השיג מתאימה לניסויים immunoprecipitation כרומטין, כפי שהודגמה בעזרת הפרופילים עבור גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות. האירועים איגוד זוהה באמצעות כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה הם בעיקר אלה מתרחשים גרעינים סיבי השריר למרות נוכחותם של כרומטין של הלווין האחר הקשורים סיבים ותאי אנדותל. פרוטוקול זה לכן מותאם ללמוד הכונה בשריר השלד העכבר למבוגרים.
Introduction
Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מצמידים תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), רצף תפוקה גבוהה (צ’יפ-seq) הפכו את השיטות של הבחירה ללמוד שעתוק ו epigenetic בקרת גנים ברקמות שונות סוגי תאים1. טכניקה זו מאפשרת הגנום כולו פרופיל של שינויים כרומטין קוולנטיות, תפוסת variant היסטון שעתוק מקדם האיגוד2,3.
בזמן ביצוע שבב של תאים בתרבית וותיקה, השבב של רקמות יונקים נשאר יותר מאתגר. הכנת כרומטין שבב כרוך במספר שלבים קריטיים צריך להיות מותאם לכל סוג הרקמה והתא. כרומטין ניתן להכין את lysates הסלולר של תאים בתרבית או טיהור הבאים בגרעין. במקרה של רקמות יונקים, פירוק יעיל קיבוע פורמלדהיד, טיהור של גרעינים הם קריטיים כדי להבטיח התאוששות אופטימלי של כרומטין. יתר על כן, לבחור לתקן הגרעינים לפני או אחרי טיהור שלהם צריך להיקבע השפעול. למרות משוכות אלה, שבב בוצעה בהצלחה רקמות כמו הכבד, testis, או המוח4,5,6. במקרה של שריר השלד, שיבוש כזה עמיד פיזית טישו, אשר מוצגים תכולה גבוהה של חלבונים מבניים, ובידוד של הגרעינים שלה הוא מאתגר במיוחד. בהתחשב סגוליות זה, פרוטוקולים ממוטב בשביל לרקמות אחרות לא נותנים תוצאות משביעות רצון לשרירי השלד.
כאן נתאר פרוטוקול לבודד את השבב-כיתה כרומטין של רקמת שריר השלד העכבר המערבת פיזית לשבש את הרקמה, קיבוע פורמלדהיד, ולאחר מכן הבידוד של גרעינים, sonication. היעילות של שיטה זו להכין כרומטין מתאים שבב מרקמות זה הודגם על-ידי ביצוע שבב-qPCR וצ’יפ-seq עבור שונים גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות7.
טכניקה חדשה זו הרבה יותר מהר מאשר פרוטוקול שדווחה בעבר8 הכוללת זמן collagenase עיכול צעדים אשר במהלכו, שינויים לוקליזציה גנומית של גורמי שעתוק, שינויים בביטוי הגנים יכול להתרחש. מהירות שבה הם הגרעינים מבודד ו קבוע הופך את השיטה המתוארת כאן אטרקטיביים במיוחד להכין כרומטין הלוכד יותר בנאמנות את המדינה יליד תפוסת גנומית. יתר על כן, למרות שיש שיטות נוספות כרומטין בידוד חלבון או חילוץ של רקמת שריר יש כבר מתואר8,9,10 ומשמש לניסויים שבב-qPCR את הגנים הנבחר, אין שבב-seq נתונים דווחה השימוש בהם. שיטת דיווח כאן מתאים שעתוק מקדם, היסטון השינוי שבב-seq, ולכן צריכה להיות גם מתאים 3 / 4C או היק כרומטין קונפורמציה ללכוד יישומים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר פרוטוקול הרומן להכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר הבוגרים ולהראות כי כרומטין הזה מתאים ניסוי שבב לזהות איגוד פקטור שעתוק והשינויים היסטון קוולנטיות גרעינים סיבי השריר. פרוטוקול זה כרוך במספר שלבים קריטיים. הראשונה היא הפרעה רקמות שניתן לבצע דאונס או באמצעות הטיית מכני. הטיית מכנ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים כל הסגל של המתקן רצף של תפוקה גבוהה IGBMC, חבר קונסורציום “צרפת Génomique” (ANR10-INBS-09-08), כל שירותי כללית IGBMC בפרט הצוות של המתקן בעלי חיים IGBMC. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של CNRS, INSERM של AFM, le חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן, הצרפתים המדינה קרן דרך ANR תחת התוכנית d’Avenir Investissements מתויג ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 ובפרמטר ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. S. J נתמך על ידי le חדר מרווח וחדיש של הליגה הלאומית לסרטן ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, ואת V.U על ידי l’Enseignement דה Ministère et de la Recherche. מזהה הוא “נבחרת labellisée” של לה חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Referencias
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
