Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico
Summary
Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.
Abstract
Descriviamo un protocollo efficiente e riproducibile per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Muscoli degli arti sezionati da topi adulti fisicamente sono interrotte da omogeneizzazione meccanica, o una combinazione di macinazione e douncing, in un buffer ipotonico prima della fissazione della formaldeide del lysate delle cellule. I nuclei fissi sono purificati da ulteriori cicli di omogeneizzazione meccanica o douncing e filtrazioni sequenziale per rimuovere i detriti cellulari. I nuclei purificati possono essere sonicati immediatamente o in una fase successiva dopo il congelamento. La cromatina può essere sonicata in modo efficiente ed è adatto per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina, come illustrato dai profili ottenuto per fattori di trascrizione, la RNA polimerasi II e modificazioni istoniche covalente. L’associazione di eventi rilevati utilizzando la cromatina preparata dal presente protocollo è principalmente quelli che si svolgono nei nuclei della fibra di muscolo nonostante la presenza di cromatina da altro satellite fibra-collegato e cellule endoteliali. Questo protocollo è pertanto adattato per studiare la regolazione genica in muscolo scheletrico del topo adulto.
Introduction
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e sequenziamento ad alta (ChIP-seq) sono diventati i metodi di scelta per lo studio di trascrizione e regolazione epigenetica dell’espressione genica in vari tessuti e tipi di cellule1. Questa tecnica permette di genoma profilatura di modificazioni covalenti della cromatina, occupazione variante dell’istone e fattore di trascrizione associazione2,3.
Mentre l’esecuzione di ChIP da cellule coltivate è ben consolidata, ChIP da tessuti di mammiferi rimane più impegnativo. Preparazione della cromatina per ChIP prevede diversi passaggi critici che devono essere ottimizzate per ogni tipo di tessuti e cellule. Cromatina può essere preparata da lisati cellulari delle cellule coltivate o seguente purificazione dei loro nuclei. Nel caso di tessuti di mammiferi, efficiente Lisi, fissazione di formaldeide e purificazione dei nuclei sono fondamentali al fine di garantire un recupero ottimale della cromatina. Inoltre, la scelta se risolvere i nuclei prima o dopo la loro purificazione deve essere determinato sperimentalmente. Nonostante questi ostacoli, il ChIP è stato eseguito con successo da tessuti quali fegato, testicolo o cervello4,5,6. Nel caso del muscolo scheletrico, la rottura di un tessuto resistente fisicamente, che esibisce un alto contenuto di proteine strutturali e l’isolamento dei suoi nuclei è particolarmente impegnativa. Data questa specificità, protocolli ottimizzati per altri tessuti non danno risultati soddisfacenti per i muscoli scheletrici.
Qui descriviamo un protocollo per isolare la cromatina ChIP-grado da tessuto muscolare scheletrico del mouse che coinvolge fisicamente interrompendo il tessuto, fissazione di formaldeide e quindi l’isolamento dei nuclei e sonicazione. L’efficienza di questo metodo per preparare cromatina adatta per ChIP da questo tessuto è stato dimostrato eseguendo ChIP-qPCR e ChIP-seq per vari fattori di trascrizione, RNA polimerasi II e istone covalente modifiche7.
Questa nuova tecnica è molto più veloce di un protocollo precedentemente segnalati8 composto da lunghi passaggi di digestione della collagenosi durante i quali, cambiamenti nella localizzazione genomica dei fattori di trascrizione e le alterazioni nell’espressione genica possono aver luogo. La rapidità con cui i nuclei sono isolati e fissa rende particolarmente attraente per preparare della cromatina che cattura più fedelmente lo stato nativo occupazione genomico il metodo qui descritto. Inoltre, anche se hanno altri metodi per l’estrazione di isolamento o proteine della cromatina da tessuto muscolare sono stato descritto8,9,10 e utilizzato per esperimenti di ChIP-qPCR su geni selezionati, nessun ChIP-seq dati sono stati segnalati li utilizzano. Il metodo segnalato qui è adatto per la modifica di fattore e istone trascrizione ChIP-seq e quindi dovrebbe anche essere adatto per 3 / 4C o applicazioni di acquisizione di HiC cromatina conformazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un romanzo protocollo per la preparazione della cromatina da muscoli scheletrici topo adulto e dimostrano che la cromatina è adatta per gli esperimenti di ChIP che rilevano associazione di fattore di trascrizione e modificazioni istoniche covalente nei nuclei della fibra di muscolo. Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la rottura del tessuto che possa essere eseguita mediante lisata o tosatura meccanica. Cesoia meccanica è più veloce e più riproducibile e pertanto è il meto…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutto il personale della struttura di sequenziamento di IGBMC elevato throughput, un membro del Consorzio “Francia Génomique” (ANR10-INBS-09-08) e tutti i servizi generali di IGBMC in particolare il personale della struttura animale IGBMC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CNRS, INSERM, l’AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, i francesi dichiarano fondo attraverso l’ANR nell’ambito del programma d’Avenir Investissements etichettati ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e il ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Santiago è stata sostenuta dal Ligue Nationale contre le Cancer, ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U dal Ministère de l’enseignement et de la Recherche. ID è un ‘équipe labellisée’ della Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Referencias
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- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
