Forbedret protokollen for Chromatin Immunoprecipitation fra musen skjelettlidelser muskel
Summary
En ny protokoll for utarbeidelsen av chromatin fra voksen mus Skjelettmuskel tilpasset å studere genet regulering i muskelfibre av chromatin immunoprecipitation presenteres.
Abstract
Vi beskriver en effektiv og reproduserbar protokoll forberedelse til chromatin fra voksen mus skjelettmuskulatur, en fysisk motstandsdyktig vev med høyt innhold av strukturelle proteiner. Dissekert lem muskler fra voksen mus avbrutt fysisk av mekanisk homogenisering eller en kombinasjon av hakking og douncing, i en hypotonisk buffer før formaldehyd fiksering av cellen lysate. Fast kjerner blir renset ved ytterligere sykluser av mekanisk homogenisering eller douncing og sekvensiell filtrations fjerne celle rusk. Renset kjerner kan være sonicated umiddelbart eller senere etter frysing. Chromatin kan være effektivt sonicated og er egnet for chromatin immunoprecipitation eksperimenter, som illustrert ved profilene oppnådd for transkripsjonsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente histone modifikasjoner. Bindende hendelsene oppdaget bruker chromatin utarbeidet av denne protokollen er hovedsakelig de skjer i muskel fiber kjerner til tross for tilstedeværelsen av chromatin fra andre fiber-assosiert satellitt og endotelceller. Denne protokollen er derfor tilpasset å studere genet regulering i voksen mus skjelettmuskelen.
Introduction
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) koblet til kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) og høy gjennomstrømning sekvensering (ChIP-seq) har blitt metodene ønsker å studere transkripsjon og epigenetic regulering av genuttrykk i ulike vev og celletyper1. Denne teknikken tillater genomet hele profilering av kovalente chromatin modifikasjoner, histone variant innkvartering og transkripsjon faktor bindende2,3.
Mens utføre ChIP fra kulturperler celler er godt etablert, fortsatt ChIP fra pattedyr vev mer utfordrende. Forbereder chromatin ChIP innebærer flere kritiske trinn som må optimaliseres for alle vev og celle type. Chromatin kan tilberedes fra mobilnettet lysates kulturperler celler eller følgende rensing av sine atomkjerner. I pattedyr vev er effektiv lysis formaldehyd fiksering og rensing av kjerner avgjørende for å sikre optimal utvinning av chromatin. Videre har et valg om å fastsette kjerner før eller etter rensing bestemmes eksperimentelt. Til tross for disse hindrene, har ChIP blitt vellykket utført fra vev som leveren, testikkel eller hjernen4,5,6. Skjelettmuskel er avbrudd i slike en fysisk motstandsdyktig vev, som har et høyt innhold av strukturelle proteiner og isolasjon av sin kjerner spesielt utfordrende. Gitt denne spesifisitet, gir protokoller optimalisert for andre vev ikke tilfredsstillende resultater for skjelettmuskulatur.
Her beskriver vi en protokoll for å isolere ChIP-klasse chromatin fra musen skjelettlidelser muskelvev som innebærer fysisk forstyrre vevet, formaldehyd fiksering og isolasjon av kjerner og sonication. Effektiviteten av denne metoden å forberede chromatin egnet for ChIP fra dette vevet ble demonstrert av utføre ChIP-qPCR og ChIP-seq for ulike transkripsjonsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente histone modifikasjoner7.
Denne nye teknikken er mye raskere enn tidligere rapportert protokoll8 består av lange collagenase fordøyelsen trinn der tiden, endringer i genomisk lokalisering av transkripsjonsfaktorer endringer i genuttrykk kan skje. Hurtighet som kjerner er isolert og fast gjør metoden beskrevet her spesielt attraktivt å forberede chromatin som fanger mer trofast innfødt genomisk bruk staten. Videre, selv om andre metoder for chromatin isolasjon eller protein utvinning fra muskelvev har blitt beskrevet8,9,10 og brukes for ChIP-qPCR eksperimenter på valgte gener, ingen ChIP-seq dataene har blitt rapportert med dem. Metoden rapporterte her er egnet for transkripsjon faktor og histone endring ChIP-seq, og dermed bør være også egnet for 3 / 4C eller HiC chromatin konformasjon fange programmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en ny protokoll for å forberede chromatin fra voksen musen muskler og vise at denne chromatin er egnet for ChIP eksperimenter som oppdager transkripsjon faktor bindende og kovalente histone modifikasjoner i muskel fiber kjerner. Denne protokollen innebærer flere kritiske trinn. Først er vev avbrudd som kan utføres enten ved dounce eller mekanisk klipping. Mekanisk shearing er raskere og mer reproduserbare, og er derfor metoden for valg. Hvis ingen passende apparater er tilgjengelig, kan likevel avbru…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle ansatte IGBMC høy gjennomstrømning sekvensering anlegget, medlem av “Frankrike Génomique” consortium (ANR10-INBS-09-08) og alle IGBMC generelle tjenester spesielt hos IGBMC dyr anlegget. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kreft, franskmenn stat fond gjennom ANR programmet Investissements d’Avenir merket ANR-10-IDEX-0002-02, den Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 og ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. S.J ble støttet av Ligue Nationale contre le kreft og ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 og V.U av Ministère de l’Enseignement et de la Recherche. ID er en ‘équipe labellisée’ Ligue Nationale contre le kreft.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Referencias
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
