Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.
Abstract
O uso de técnicas de imagem já avançando contribuiu largamente para nossa maior compreensão do desenvolvimento embrionário. Organogênese e desenvolvimento pré-implantação são duas áreas de investigação que se beneficiaram enormemente destes avanços, devido à alta qualidade dos dados que podem ser obtidos diretamente a partir de imagens de pré-implantação embriões ou ex vivo de órgãos. Enquanto os embriões pré-implantação produziram dados com especialmente alta resolução espacial, estágios posteriores foram menos passíveis de reconstrução tridimensional. Obtenção de dados de alta qualidade 3D ou volumétricos para estruturas embrionárias conhecidas em combinação com mapeamento de destino ou rastreamento de linhagem genética permitirá uma análise mais abrangente dos acontecimentos morfogenéticas ocorrendo durante a embriogênese.
Este protocolo descreve uma abordagem de imunofluorescência toda a montagem que permite a rotulagem, visualização e quantificação de populações de células progenitoras dentro o desenvolvimento crescente cardíaca, uma chave estrutura formada durante o desenvolvimento do coração. A abordagem é projetada de tal forma que ambas as informações de nível de células e tecidos podem ser obtidos. Utilizando microscopia confocal e processamento de imagem, este protocolo permite a reconstrução espacial tridimensional do crescente cardíaca, proporcionando assim a capacidade de analisar a localização e organização das populações específicas progenitor durante nesta fase crítica do desenvolvimento do coração. Importante, o uso de anticorpos de referência permite sucessivo mascaramento do crescente cardíaca e subsequentes medições quantitativas das áreas dentro do crescente. Este protocolo permitirá não só um exame detalhado do desenvolvimento inicial do coração, mas com adaptações deverá ser aplicável à maioria dos sistemas de órgãos na gástrula de embrião somite palco do mouse.
Introduction
O estudo da organogênese tem tempo baseou-se na observação de eventos morfogenéticas no desenvolvimento do embrião. Esses estudos dependem frequentemente o uso de corantes fluorescentes ou repórteres de rastreamento linhagem em combinação com rotulagem das populações de referência definido. 1 , comparando a posição relativa desses rótulos, informações podem ser recolhidas na origem, movimento ou derradeira contribuição de uma população de interesse. Transplante e experimentos de mapeamento de destino usam Marcos morfológicos ou injeção de corantes em non-motile linhagens para definir o ponto de partida das células de interesse, que são então examinadas pela contribuição para o embrião desenvolvido. 2 , 3 , 4 , 5 experiências genéticas de linhagem de rastreamento usam o mesmo conceito com alelos repórter bem definidas que são usadas para populações de células rótulo sem manipulação experimental. Chave para essas abordagens é a capacidade de determinar, com alta resolução espacial, os locais de experimental e rótulos de referência. Estas abordagens têm rendido notável progresso no desenvolvimento de pré-implantação e explantes estudos organogênese. 6 , 7 , 8 , 9
Os eventos do desenvolvimento que sustentam a morfogênese de coração têm sido cada vez mais bem descritos nos últimos anos. 10 uma das principais descobertas nesta área de pesquisa é a descrição de um número de populações de progenitor que podem ser distinguidos pela expressão de marcadores exclusivos. 11 estas populações incluem o primeiro e segundo campos de coração (FHF e SHF), que estão presentes dentro do crescente cardíaco no lado anterior do embrião no dia embrionário (E) 8.25 do desenvolvimento do mouse. 12 estas populações são frequentemente examinadas através de uma combinação de microscopia campo amplo, que fornece informações de nível de tecido e seccionamento serial com ensaios de imunofluorescência, que oferece alta resolução celular mas só informações espaciais bidimensionais. 13 assim, enquanto estes estudos avançaram grandemente a nossa compreensão do desenvolvimento do coração, os métodos disponíveis têm limitado na análise quantitativa de profundidade da morfogênese durante esses estágios, criando a necessidade de abordagens examinar o organização dessas populações a nível de todo o organismo.
Os recentes avanços em microscopia confocal e análise de imagem 3D permitem reconstruções algorítmicas de alta resolução e elevado-produção de células e estruturas em situ com relativa facilidade, assim, abrindo o caminho para estudos detalhados do complexo estruturas celulares. 14 com o aumento do poder computacional e o desenvolvimento de algoritmos gerenciamento de grande volume de dados, ambas necessárias para lidar com o aumento exponencial do tamanho da imagem latente conjuntos de dados, análises podem agora ser totalmente automatizadas. 15 análise automatizada de conjuntos de dados de imagem tem a vantagem de ser imparcial, mas só é tão confiável quanto a qualidade do conjunto de dados entrada; é imperativo, então, que as práticas recomendadas são usadas durante a aquisição e pré-processamento de imagem para garantir a mais alta qualidade, a análise imparcial. 16 protocolos podem ser completamente automatizado e compartilhado para reprodutibilidade, e os algoritmos usados pelo software proprietário estão prontamente disponíveis através de bibliotecas para ser usado por cientistas que têm familiaridade com moderna proprietárias ou open source ferramentas de desenvolvedor. 17
O protocolo a seguir explica os passos necessários para executar tal análise em um modelo bem definido da organogênese, a formação do crescente cardíaca durante o desenvolvimento do coração. Especificamente, este protocolo descreve como (1) colheita e dissecar embriões estágio crescente cardíaca, (2) executar toda montagem imunofluorescência para referência (Nkx2-5) e experimental (Foxa2Cre:YFP18,19) marcadores, (3) Prepare-se e os embriões utilizando microscopia confocal, de imagem e, finalmente, (4) analisar e quantificar as imagens resultantes usando abordagens avançadas tridimensionais. Enquanto o crescente cardíaco é usado como um exemplo aqui, com modificações apropriadas, este protocolo pode ser utilizado para análise de várias linhagens em gástrula de embriões adiantados do palco somite.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descreve uma estratégia para a obtenção de dados quantitativos de imagens de alta qualidade toda montagem imunofluorescência de embriões do rato após a implantação. Quando realizado corretamente, os dados volumétricos 3D gerados através desses passos podem ser usados para a análise comparativa e interseccional de vários domínios dentro do embrião. O sinal de superfície mascarando a abordagem descrita é de uso particular na investigação de populações de células romance em comparaçã…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH/NHLBI R56 HL128646 e Mindich criança saúde e Instituto de desenvolvimento (MCHDI) em ISMMS (para N.D.). E.B. é suportado por um NIH/NIDCR estágio T32 HD075735. Microscopia e análise de imagem, realizou-se no núcleo microscopia o Icahn School of Medicine, no Monte Sinai, que é suportado em parte pelo Instituto do câncer Tisch no Mount Sinai P30 CA196521 – câncer centro de concessão de apoio.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
Referencias
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
