Summary

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Published: July 31, 2017
doi:

Summary

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。

Abstract

全細胞パッチクランプは、単細胞の電気的特性を測定する金標準的な方法です。しかし、 インビトロパッチクランプは、その複雑さおよびユーザの操作および制御への高い依存性のために、依然として困難で低スループットの技術である。この原稿は、急性脳スライスにおけるin vitro全細胞パッチクランプ実験のための画像ガイド自動パッチクランプシステムを実証しています。我々のシステムは、蛍光標識された細胞を検出し、マイクロマニピュレーターおよび内部のピペット圧力制御を用いた完全自動パッチングのためにそれらを標的にするコンピュータビジョンベースのアルゴリズムを実施する。プロセス全体は高度に自動化されており、人間の介入に対する必要条件は最小限に抑えられています。電気抵抗および内部ピペット圧力を含むリアルタイムの実験情報は、将来の分析および異なる細胞タイプへの最適化のために電子的に文書化されている。我々のシステムは、急性のbraiの文脈で記述されているn個のスライスレコーディングのために、解離ニューロン、器官型スライス培養物、および他の非ニューロン細胞タイプの自動画像誘導パッチクランプにも適用することができる。

Introduction

パッチクランプ技術は、興奮性膜のイオンチャンネルを研究するために1970年代にNeherとSakmannによって最初に開発されました1 。それ以来、パッチクランプは、ニューロン、心筋細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、人工リポソームを含む多くの異なる細胞タイプにおいて、細胞、シナプスおよび回路レベル( インビトロおよびインビボの両方) 多くの異なる被験者の研究に適用されている2 。このプロセスは、細胞の正確な同定および標的化、細胞に近接してパッチピペットを動かすための複雑なマイクロマニピュレーター制御、適切な時間に陽圧および陰圧をピペットに適用して緊密なギガシールパッチを確立すること、セル全体のパッチ構成を確立するためのブレークインなどがあります。パッチクランプは、通常は手作業で行われ、マスタリングには大規模なトレーニングが必要です。パッチを経験した研究者であってもクランプ、成功率は比較的低いです。より最近では、パッチクランプ実験を自動化するためのいくつかの試みがなされている。自動化を達成するために2つの主要な戦略が進化しました。標準的なパッチクランプ装置を増強して、パッチ適用プロセスの自動制御と、新しい装置と技術の設計を根本から行いました。前者の戦略は、既存のハードウェアに適応可能であり、 インビボブラインドパッチクランプ3、4、5、急性脳切片のin vitroでのパッチクランプ、器官型スライス培養物含め、パッチクランプ種々の用途に使用することができ、培養解離ニューロン6 。これは、複数のマイクロマニピュレータを同時に使用することにより、複雑なローカル回路の照会を可能にします7 。平面パッチ法は、新しい開発戦略の一例であり、高スループットの同時p薬物スクリーニング目的のための懸濁液中の細胞のクランプクランプ8 。しかしながら、平面パッチ法は、全ての細胞型、特に、長いプロセスを有するニューロンまたは広範な接続を含むインタクトな回路には適用できない。これは、従来のパッチクランプ技術の重要な利点である、神経系の複雑な回路をマッピングすることへのその適用を制限する。

我々は、標準的なパッチクランプハードウェアを増強することにより、手動パッチクランププロセスをインビトロで自動化するシステムを開発しました。当社のシステムであるオートパックャーIGは、自動ピペット校正、蛍光細胞標的同定、ピペット移動の自動制御、自動全細胞パッチ、およびデータロギングを提供します。このシステムは、異なる深さの脳スライスの複数の画像を自動的に獲得することができる。コンピュータビジョンを使ってそれらを分析する。蛍光標識された細胞の座標を含む情報を抽出する。この情報は、目的の細胞を標的とし、自動的にそれをパッチするために使用される。このソフトウェアは、いくつかのオープンソースライブラリを使用して、無料のオープンソースプログラミング言語であるPythonで書かれています。これにより、他の研究者へのアクセシビリティが確保され、電気生理学実験の再現性と厳しさが向上します。このシステムはモジュラー設計を採用しているため、追加のハードウェアをここで示した現在のシステムと容易にインターフェースすることができます。

Protocol

1.システムセットアップ圧力制御ユニットを構成します。 回路マップに従って圧力制御ユニットを組み立てます( 図1 )。電気回路図に従って製造されたプリント回路基板(PCB)に必要な部品を半田付けします ( 図1b )。標準の抵抗、LED、金属酸化物半導体電界効果トランジスタ(MOSFET)、コンデンサ、およ?…

Representative Results

我々のシステムは、急性脳スライス、ニューロンに分化したマウス誘発多能性幹細胞(iPSC)、および関心のあるチャネルを人工的に発現するHEK293細胞に細胞をパッチする能力に関して試験されている。 図3は、視覚野における蛍光標識層5ピラミッドニューロンを標的とするThy1-ChR2-YFPトランスジェニックマウス(B6.Cg-Tg(Thy1-COP4 / EYFP)18Gfng /…

Discussion

ここでは、インビトロで自動画像ガイドパッチクランプ記録のための方法を説明する。このプロセスの主要なステップを以下に要約します。まず、コンピュータビジョンを使用して、顕微鏡で取得した一連の画像を使用してピペットチップを自動的に認識させます。この情報は、次に、顕微鏡とマニピュレータ座標系との間の座標変換関数を計算するために使用される。コンピュータ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ホワイトホール財団の資金援助に感謝します。貴重なコメントをいただいたSamuel T. Kissinger氏に感謝します。

Materials

CCD Camera QImaging Rolera Bolt
Electrophysiology rig Scientifica SliceScope Pro 2000 Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer Molecular Devices Axon Digidata 1550
LED light source Cool LED pE-100 488nm wavelength
Data acquisition board Measurement Computing USB1208-FS Secondary DAQ.
See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves The Lee Co. LHDA0531115H
Air pump Virtual industry VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor Freescale semiconductor MPXV7025G
Slice hold-down Warner instruments 64-1415 (SHD-40/2) Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python Anaconda version 2.7 (32-bit for windows) https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals Sparkfun PRT – 08084 Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60V 30A Sparkfun COM – 10213
DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin Sparkfun PRT-07937
LED – Basic Red 5mm Sparkfun COM-09590
LED – Basic Green 5mm Sparkfun COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) Sparkfun PRT-12748
Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA Sparkfun TOL-09442
Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) Sparkfun PRT-11367
Locking Male x Female X Female Stopcock ARK-PLAS RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings Fisher scientific 14-171-129 Outer Diameter: 1/8 in.
Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable Belkin Components F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance) Radioshack 2711116
Picospritzer General Valve Picospritzer II

Referencias

  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  3. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  4. Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
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  6. Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
  7. Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
  8. Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
  10. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
  11. Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
  12. Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).

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Citar este artículo
Wu, Q., Chubykin, A. A. Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices. J. Vis. Exp. (125), e56010, doi:10.3791/56010 (2017).

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