Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга
Summary
В этом протоколе описывается, как проводить автоматические эксперименты по патч-зажимам с использованием изображений с использованием системы, недавно разработанной для стандартного электрофизиологического оборудования in vitro .
Abstract
Цельноклеточный патч-зажим является золотым стандартным методом для измерения электрических свойств отдельных клеток. Тем не менее, патч-фиксатор in vitro остается сложной и малопроизводительной техникой из-за ее сложности и высокой зависимости от работы и управления пользователем. В этой рукописи демонстрируется автоматическая система патч-фиксации, управляемая ими, для экспериментов с целыми клеточными зажимами in vitro в острых срезах мозга. Наша система реализует алгоритм, основанный на компьютерном зрении, для обнаружения флюоресцентно меченых ячеек и нацеливания на их полностью автоматическое исправление с использованием микроманипулятора и внутреннего контроля давления пипетки. Весь процесс очень автоматизирован, с минимальными требованиями к вмешательству человека. Экспериментальная информация в режиме реального времени, включая электрическое сопротивление и внутреннее давление пипетки, документируется в электронном виде для будущего анализа и оптимизации для разных типов ячеек. Хотя наша система описывается в контексте острого braiN, она также может быть применена к автоматизированному патч-клипу с ориентацией на изображение диссоциированных нейронов, органотипических культур срезов и других типов нейнерональных клеток.
Introduction
Техника патч-зажима была впервые разработана Нехером и Сакманом в 1970-х годах для изучения ионных каналов возбудимых мембран 1 . С тех пор патч-зажим был применен к изучению многих разных субъектов на клеточном, синаптическом и контурном уровне – как in vitro, так и in vivo – во многих разных типах клеток, включая нейроны, кардиомиоциты, ооциты Xenopus и искусственные липосомы 2 , Этот процесс включает в себя правильную идентификацию и нацеливание ячейки, представляющей интерес, сложное управление микроманипулятора для перемещения пипетки патча в непосредственной близости от клетки, применение положительного и отрицательного давления к пипетке в надлежащее время для создания плотного гигасеального пластыря, И взлом, чтобы установить конфигурацию патчей цельной ячейки. Зажим патча, как правило, проводится вручную и требует обширного обучения. Даже для исследователя, испытывающего патчЗажим, уровень успеха относительно низок. Совсем недавно было предпринято несколько попыток автоматизировать эксперименты по патч-зажимам. Для достижения автоматизации были разработаны две основные стратегии: расширение стандартного оборудования для зажима патчей для обеспечения автоматического контроля процесса исправления и разработки нового оборудования и технологий с нуля. Бывшая стратегия адаптируется к существующим аппаратным средствам и может использоваться в различных приложениях патч-зажима, в том числе in vivo слепой патч-зажим 3 , 4 , 5 , патч-зажим in vitro острых срезов головного мозга, органотипические срезы кусочков и культивированные диссоциированные нейроны 6 , Это позволяет проводить опрос сложных локальных схем с одновременным использованием нескольких микроманипуляторов. 7 . Метод планарных патчей является примером новой стратегии разработки, которая может обеспечить одновременное выполнение высокопроизводительной pФиксация клеток в суспензии для скрининга наркотиков 8 . Однако метод планарных пятен не применим ко всем типам клеток, особенно к нейронам с длинными процессами или целыми цепями, содержащими обширные соединения. Это ограничивает его применение для картирования сложных схем нервной системы, что является ключевым преимуществом традиционной технологии патч-зажима.
Мы разработали систему, которая автоматизирует процесс ручного патч-клеща in vitro , дополняя стандартное аппаратное обеспечение патча. Наша система, Autopatcher IG, обеспечивает автоматическую калибровку пипетки, идентификацию целевых ячеек флуоресцентных клеток, автоматическое управление перемещением пипетки, автоматическое клонирование целых ячеек и регистрацию данных. Система может автоматически получать множественные изображения срезов мозга на разных глубинах; Анализировать их с помощью компьютерного зрения; И извлекают информацию, включая координаты флюоресцентно меченных клеток. Затем эта информация может бытьИспользуется для таргетинга и автоматического исправления интересующих ячеек. Программное обеспечение написано на Python – свободном языке программирования с открытым исходным кодом – с использованием нескольких библиотек с открытым исходным кодом. Это обеспечивает его доступность для других исследователей и улучшает воспроизводимость и строгость экспериментов по электрофизиологии. Система имеет модульную конструкцию, так что дополнительное оборудование может быть легко сопряжено с текущей системой, продемонстрированной здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод автоматической записи патч-зажима с использованием изображений in vitro . Основные этапы этого процесса суммируются следующим образом. Во-первых, компьютерное зрение используется для автоматического распознавания наконечника пипетки с помощью серии изобра…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за финансовую поддержку Фонда Уайтхолла. Мы хотели бы поблагодарить Самуэля Т. Киссинджера за ценные замечания.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
Referencias
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
