Summary

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Published: July 31, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

Abstract

מהדק תיקון של כל התא הוא שיטה סטנדרטית זהב למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים בודדים. עם זאת, במבחנה תיקון מהדק נשאר מאתגר נמוך התפוקה הטכניקה בשל המורכבות שלה ואת ההסתמכות הגבוהה על פעולת המשתמש ושליטה. כתב יד זה מדגים תמונה מודרכת אוטומטית תיקון מערכת מהדק עבור במבחנה כולו תא תיקון ניסויים מהדק פרוסות המוח חריפה. המערכת שלנו מיישמת מחשב מבוסס חזון אלגוריתם כדי לזהות תאים שכותרתו fluorescently ו למקד אותם עבור תיקון אוטומטי מלא באמצעות micromanipulator ואת השליטה הפנימית פיפטה הלחץ. התהליך כולו הוא אוטומטי מאוד, עם דרישות מינימליות להתערבות אנושית. מידע ניסיוני בזמן אמת, כולל התנגדות חשמלית ולחץ פיפטה פנימי, מתועדים בצורה אלקטרונית לניתוח עתידי ולאופטימיזציה לסוגים שונים של תאים. למרות שהמערכת שלנו מתוארת בהקשר של בריאה חריפהN הקלטות פרוסה, זה יכול גם להיות מיושם על התמונה אוטומטית מודרך תיקון מהדק של נוירונים מנותקים, תרבויות פרוסות organotypic, וסוגים אחרים של תאים שאינם נוירונים.

Introduction

הטכניקה מהדק תיקון פותחה לראשונה על ידי Neher ו Sakmann בשנות ה -70 ללמוד את הערוצים היוניים של ממברנות נרגש 1 . מאז, תיקון clamping הוחל על המחקר של נושאים שונים רבים ברמה התאית, הסינפטית והמעגלית – הן במבחנה והן ב- vivo – בסוגי תאים שונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים, ביציות Xenopus וליפוזומים מלאכותיים 2 . תהליך זה כרוך זיהוי נכון ומיקוד של תא של עניין, שליטה micromanipulator מורכבים להעביר את פיפטה תיקון בקרבה לתא, היישום של לחץ חיובי ושלילי פיפטה בזמן הנכון להקים תיקון gigaseal הדוק, ואת הפריצה להקים תצורה שלמה תיקון התאים. תיקון clamping מתבצעת בדרך כלל ידני דורש הכשרה מקיפה כדי לשלוט. אפילו עבור חוקר מנוסה עם התיקוןמהדק, שיעור ההצלחה נמוך יחסית. לאחרונה, כמה ניסיונות נעשו כדי להפוך את הניסויים תיקון clamp. שתי אסטרטגיות עיקריות התפתחו כדי להשיג אוטומציה: הגדלת תקן מתקן מהדק תיקון לספק בקרה אוטומטית של תהליך התיקון ואת העיצוב של ציוד וטכניקות חדשות מהיסוד. האסטרטגיה לשעבר היא הסתגלות החומרה הקיימת ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים מהדק תיקון, כולל vivo עיוור תיקון מהדק 3 , 4 , 5 , מהדק תיקון במבחנה של פרוסות מוח חריפה, תרבויות פרוסה organotypic, נוירונים מנותקים תרבותית 6 . זה מאפשר חקירה של מעגלים מקומיים מורכבים באמצעות micromanipulators מרובים בו זמנית 7 . שיטת התיקון המישורית היא דוגמה לאסטרטגיית הפיתוח החדשה, אשר יכולה להשיג את התפוקה הגבוהה בו-זמניתאטך מהדק של תאים ההשעיה למטרות הסריקה תרופה 8 . עם זאת, שיטת תיקון מישורי אינו מתאים לכל סוגי התאים, במיוחד נוירונים עם תהליכים ארוכים או מעגלים שלמים המכילים חיבורים נרחבים. זה מגביל את היישום שלה כדי מיפוי מעגלים מורכבים של מערכת העצבים, המהווה יתרון מרכזי של הטכנולוגיה המסורתית תיקון מהדק.

פיתחנו מערכת אשר ממכן את תהליך הידוק תיקון הידן במבחנה על- ידי הגדלת חומרה סטנדרטי תיקון מהדק. המערכת שלנו, Autopatcher IG, מספק כיול פיפטה אוטומטי, זיהוי תא פלואורסצנטי זיהוי, שליטה אוטומטית של תנועת פיפטה, תיקון אוטומטי כל התא, ואת נתוני רישום. המערכת יכולה באופן אוטומטי לרכוש תמונות מרובות של פרוסות המוח בעומקים שונים; לנתח אותם באמצעות ראיית מחשב; ו לחלץ מידע, כולל את הקואורדינטות של תאים שכותרתו fluorescently. מידע זה יכול להיותהמשמש לכוון תאים תיקון אוטומטי של עניין. התוכנה נכתבת בפייתון – שפת תכנות חופשית וקוד פתוח – באמצעות מספר ספריות קוד פתוח. זה מבטיח נגישות שלה חוקרים אחרים ומשפר את reproducibility וקשיחות של ניסויים electrophysiology. המערכת יש עיצוב מודולרי, כך חומרה נוספת יכולה בקלות להיות interfaced עם המערכת הנוכחית הפגינו כאן.

Protocol

.1 הגדרת מערכת לבנות את יחידת בקרת הלחץ. הרכב את יחידת בקרת הלחץ על פי מפת המעגל ( איור 1 ). הלחמה את החלקים הדרושים על לוח מעגלים מודפסים (PCB) המיוצרים על פי …

Representative Results

המערכת שלנו נבדקה על היכולת שלה תיקון תאים פרוסות מוח חריפה, עכבר המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) מובחנת לנוירונים, ו HEK 293 תאים באופן מלאכותי להביע ערוצים של עניין. איור 3 מראה ניסוי באמצעות Thy1-ChR2-YFP עכברים מהונדסים (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J)…

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה אוטומטית התמונה מונחה תיקון קלימפ הקלטות במבחנה . השלבים העיקריים בתהליך זה מסוכמים כדלקמן. ראשית, ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות את קצה פיפטה באמצעות סדרה של תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ. מידע זה משמש לאחר מכן לחשב את הפונקציה שינוי…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של קרן וייטהול. ברצוננו להודות לסמואל ט 'קיסינג'ר על ההערות החשובות.

Materials

CCD Camera QImaging Rolera Bolt
Electrophysiology rig Scientifica SliceScope Pro 2000 Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer Molecular Devices Axon Digidata 1550
LED light source Cool LED pE-100 488nm wavelength
Data acquisition board Measurement Computing USB1208-FS Secondary DAQ.
See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves The Lee Co. LHDA0531115H
Air pump Virtual industry VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor Freescale semiconductor MPXV7025G
Slice hold-down Warner instruments 64-1415 (SHD-40/2) Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python Anaconda version 2.7 (32-bit for windows) https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals Sparkfun PRT – 08084 Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60V 30A Sparkfun COM – 10213
DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin Sparkfun PRT-07937
LED – Basic Red 5mm Sparkfun COM-09590
LED – Basic Green 5mm Sparkfun COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) Sparkfun PRT-12748
Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA Sparkfun TOL-09442
Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) Sparkfun PRT-11367
Locking Male x Female X Female Stopcock ARK-PLAS RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings Fisher scientific 14-171-129 Outer Diameter: 1/8 in.
Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable Belkin Components F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance) Radioshack 2711116
Picospritzer General Valve Picospritzer II

Referencias

  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  3. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  4. Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
  5. Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
  6. Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
  7. Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
  8. Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
  10. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
  11. Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
  12. Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).

Play Video

Citar este artículo
Wu, Q., Chubykin, A. A. Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices. J. Vis. Exp. (125), e56010, doi:10.3791/56010 (2017).

View Video