提出了一种在小鼠中创建和实时映射不同人源化骨髓小生境的方法。基于由人间充质细胞产生的支持性利基,人内皮细胞的添加诱导人血管的形成,而添加rhBMP-2诱导人 – 小鼠嵌合成熟骨组织的形成。
人类造血干细胞(HSCs)存在于骨髓(BM)小生境中,这是一个复杂的多因素网络,其产生细胞因子,生长因子和细胞外基质。 HSC保持静止,自我更新或分化,获得突变并变得恶性的能力取决于它们与不同基质成分的复杂相互作用。为了观察生理和病理状态下人类HSCs与人骨骼生物圈之间的串扰,我们设计了一个方案来对免疫缺陷小鼠的人源化BM细胞进行异位模拟和成像。我们表明使用不同的细胞成分可以形成人性化的结构,并有机会维持长期的人体造血移植。使用双光子显微镜,我们可以在单细胞分辨率下原位形成这些结构,为人类BM的功能表征提供了强大的新工具微环境及其在调节正常和恶性造血作用。
在干细胞室中观察到的细胞命运决定被内在因素和外在因素紧密地调节。特别是现在人们普遍认识到,BM微环境在控制HSC从静止状态到活跃状态以及自我更新或分化命运决定1方面发挥了重要作用。此外,最近的发现表明,血液恶性肿瘤影响BM微环境的功能,指向两个隔室2,3,4,5,6之间的串扰活性的存在。尽管最近有进展,但是关于如何使特定的BM-利基组件的活动有助于HSC行为和恶性转化的许多关键问题仍然存在。
BM微环境是一种高度杂种许多不同细胞类型的复杂和复杂的混合物,每种具有专门的功能。丰富的内皮(EC)和血管组分调节营养物和代谢物周转,入口和不同小区的出口和从BM,和几个HSC功能7,8。间质基质细胞(MSC)是通过三种不同谱系( 即成骨,软骨形成,脂肪形成)分化的未分化干细胞和祖细胞的异质群体,是BM生态位的另一个基本组成部分。这些骨髓间充质干细胞在BM的中心区域和邻近内膜区域都是局部化的。它们可以与血管结构相关联,并在调节牵涉HSC功能9,10,11,12,13,“> 14,15。
许多报告表明,HSCs存在于骨髓内的各种定义的位点,并且它们的功能可能取决于它们的精确定位。关于HSC的大部分现有知识及其与BM微环境的相互作用源自鼠科研1 。利用异种移植物模型的已扩展此知识对人类正常和恶性造血干细胞,免疫缺陷小鼠16,17,18,19,20的鼠BM内移植。虽然这代表了一个有效的模型,但它仍然存在许多挑战,例如在大多数情况下需要调节受体小鼠以允许人类HSC归巢和植入或跨物种屏障及其对细胞 – 细胞相互作用的影响不明确,功能。
使用中和抗体和遗传修饰的小鼠以及异种移植一直在突出人类HSCs与其微环境建立的复杂对话。的引入和活体双光子共焦显微术的发展已经移动这些研究前进了一步,允许直接的,高分辨率,和骨髓19,20,21,22的动态成像和用于功能提供了一种强大的工具表征BM微环境及其在调节HSC功能中的作用。为了规避经典异种移植模型中出现的一些问题,将人性化骨架结构的工程概念引入了前提。合并生物材料和细胞移植概念,报告显示了模拟人类骨骼的可行性在异位区23,24,25,26,27箭头微环境。这将打开使用生物工程在小鼠模型中研究人正常和恶性造血28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,肿瘤发生和转移40,41,42的可能性,43,44。
基于在骨组织工程和体内成像19,第 22,45,46,以前的经验47,48,49,50,51,52,我们描述了一个协议,以生物工程和现场图像器官人类BM组织。这些结构起源于将人BM衍生的基质细胞植入到在免疫缺陷小鼠中皮下移植的基于胶原的支架中。在以前的报告中,我们证明了人类干细胞确保人体微环境,足以满足人体的造血细胞45的植入的形成。此外,这里我们描述如何共同植入其他人类BM细胞成分S,如人内皮细胞(HEC),和/或细胞因子用于骨形成( 例如,hBMP2转)重要的是,用的hMSCs协作以产生不同的人源微环境,其可以是实时成像原位 。
对现有方法的意义:
在这个协议中,我们描述了一种在小鼠中产生不同人源化微环境的方法,并通过双光子显微镜和组织学观察其结构。提供的代表性数据显示了该方法的可行性,使用不同的基质细胞来设计人源化组织。该方案具有在正常和病理状态下研究人类造血细胞和骨髓小生境细胞的具体应用。这些应用包括克隆进化,药物筛选和人类HSCs与基质组分之间的串扰的研究。在新兴的组织工程领域,已经提出了几种替代方法。值得注意的途径包括体外 55,56,57 3D人性化的BM结构的发展,S = “外部参照”> 58,59,60,61,62,63和人源化BM支架的小鼠64原位移植物。我们的方法具有将体内系统的复杂性与人源化组织移植物的易于解剖可及性相结合的优点。
修改和故障排除:
该方案的变异性来源可以在用于种植支架的细胞的选择中找到。在我们的工作中,我们使用BM衍生的hMSCs。然而,间充质细胞可以从几个组织获得,其可以根据来源显示出独特的性质。因此,可以考虑使用来自不同器官的hMSC。然而,它们在体内形成骨组织的能力应在本P中使用前进行测试该协议使用市售的人内皮细胞源( 即 E4ORF1转导的HUVEC)。最近,使用器官特异性内皮细胞用于不同目的的已报道65,66。此外,使用从BM导出的原代hEC可能代表协议有意义的改进。因此,使用不同来源的内皮细胞可能产生不同的体内结果。
我们使用NSG免疫抑制受体小鼠有利于植入人源化支架并避免组织排斥。我们不排除使用本协议来设计其他小鼠品系异位骨髓组织的可能性。实际上,的rhBMP-2可以诱导不同哺乳动物模型47,48的骨形成,49,50 <sup>, 52 。然而,使用不同的菌株/模型可能观察到细胞活力和长期移植的差异。
支架恢复的时间也可以灵活,这取决于实验的最终目的。在提出的方案中,我们在植入后8-12周恢复样品以评估长期造血移植。为了研究人类BM生物圈形成的早期步骤( 例如骨软骨组织形成47或血管发育),可以选择不同的时间点。
我们在本协议中描述的活体成像技术用于外植体的短期成像。用于维持生理温度,氧张力,和CO 2浓度的使用的平衡室的应在长期成像的情况下可以考虑,如研究运动的行为。
临界街议定书内的eps
在与协议相关的挑战中,我们将强调一些步骤所需的技术技能。间质和内皮细胞应以低细胞通道数使用;否则,它们将不能够支持人造血细胞植入在体内或参加从头脉管系统和骨形成体内 。我们建议在第1至5代使用hMSC和hEC。支架制备和细胞播种步骤需要基本的细胞培养技术和对该过程中使用的特定细胞的性质的了解。手术方案很简单,但需要一些实践。维持无菌环境以避免免疫缺陷小鼠中植入的支架的污染对于确保实验成功至关重要。样本外植体和活体成像需要外科手术(特别是使用微量钻屑)和知识显微镜系统。最后,样本处理和组织学需要使用的技术的基本知识。
技术局限性:
我们描述的方法允许活人人造血细胞的可视化,种植人源化骨髓微环境,人内皮细胞形成血管结构和形成骨/骨髓空间的间充质细胞。当组织在体内形成时 ,最终的工程支架仍然是嵌合(人和鼠)。应该考虑这个问题,因为嵌合组织可能不能完全模仿人骨髓复杂性和环境。
植入的支架具有有限的尺寸(我们尝试最大为6.6×7.5×7mm),因此它们能够承载有限数量的用于异种移植的细胞。回收细胞的绝对数量也将受到限制;因此,植入支架的数量应该是作为实验所需细胞数的函数计算。
我们描述的成像应用对于从表面观察150-200μm深度的大面积活体组织特别有用,而不会破坏结构并损坏细胞。因此,它不允许整个脚手架的可视化。如果需要对组织进行完全扫描,则标准的免疫荧光方法将更为合适。
未来应用:
该生物工程模型的未来方向将是增加组织中人体成分的复杂性。人类BM小众的知识和特征近年来已有进展67 ,并且所描述的方案可能是研究这些新细胞组分和可溶性因子的功能的有趣的平台,以及它们在支持正常/恶性蚂蚁HSC。
此外,成像技术提供了在纵向研究中对支架进行活体成像的潜力,这将需要在手术后恢复中对活体麻醉的小鼠中支架进行成像的技术改进。这种方法将需要额外的步骤,目前正在实验室进行调查。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢弗朗西斯·克里克研究所(生物研究机构,体内成像和实验组织病理学)和Yolanda Saavedra-Torres和梅里德斯·桑切斯·加尔松的核心设施中的工作人员,分别是Crick和LRI的兽医,为他们提供了宝贵的帮助。我们非常感谢W. Gray博士批判性地阅读手稿。 DP得到EHA非临床研究奖学金的支持。这项工作得到了弗朗西斯·克里克研究所的支持,该研究所收到了英国癌症研究中心(FC001045),英国医学研究委员会(FC001045)和欢迎信托(FC001045)的核心资金。
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |