Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

La fosforilazione della proteina in un residuo specifico svolge un ruolo significativo in una vasta gamma di processi cellulari. Pertanto, una comprensione delle reti di segnalazione richiede l'individuazione di specifici siti di fosforilazione. Inoltre, il sito di fosforilazione determina l'effetto sulla funzione proteica perché i singoli domini all'interno di una proteina possiedono strutture e funzioni diverse. L'attività del fattore nucleare eritroide 2 correlato 2 (Nrf2), un fattore chiave di trascrizione antiossidante, è bi-direzionale regolata attraverso la fosforilazione in diversi siti. I nostri studi si sono concentrati sulle chinasi che catalizzano la fosforilazione di Nrf2. La risposta dello stress di Nrf2 contro la sfida ossidativa si verifica rapidamente, principalmente attraverso la fosforilazione in serina 40 e mediata da proteina chinasi C (PKC) -δ, che attiva Nrf2 ^{3 , 4} . Al contrario, Fyn catalizza la fosforilazione inibitoria di Nrf2 alla tirosina 568 per un controllo stretto dell'attività ⁵ .

Il metodo più comune per scoprire i siti di fosforilazione è la cromatografia liquida / analisi di spettrometria di massa (LC / MS). I dati di mappatura del sito di fosforilazione rapida e altamente sensibile possono essere generati in questo modo; Tuttavia, ha diverse limitazioni tecniche, generando spesso segnali falsi negativi. Nella LC / MS analisi si riscontra frequentemente la scarsa sequenza di sequenza. Per identificare i siti di fosforilazione è richiesta informazioni sulla copertura ottimale di aminoacidi di una proteina ⁶ . La proteolisi della proteina di interesse con diverse proteasi durante la fase di digestione può aiutare a migliorare la copertura delle sequenze. Un altro ostacolo per l'identificazione dei residui di fosforilazione è l'immediata perdita di acido fosforico spesso osservata per i peptidi ^{6 , 7 ,} serine e treonina fosforilati. Le parti di fosfati Labile sono spessoRilasciato da fosfopeptidi durante il processo di frammentazione ⁷ . La seconda opzione nella ricerca di siti di fosforilazione sta utilizzando un metodo di microarray peptidico. È possibile schermare i siti di destinazione di chinasi usando un chip di microarray contenente frammenti peptidi derivanti da una proteina di interesse. Tuttavia, a causa del requisito di attrezzatura per la produzione e la rilevazione di un chip microarray, il metodo del microarray peptide è considerato tempo e costoso.

Per superare queste sfide, un test di chinasi in concorrenza in vitro con oligopeptide può essere utilizzato per una chinasi di proteina con motivi riconosciuti di riconoscimento. Se si stabilisce il motivo di riconoscimento del consenso di una chinasi, si possono prevedere siti di fosforilazione supposto di un substrato candidato e l'autenticità dei siti può essere convalidata. Il metodo più convincente per questa procedura è quello di mostrare l'abrogazione della fosforilazione in una proteina mutante in cui la predizioneD è sostituito da un aminoacido non fosforilabile ( vale a dire, sierina o treonina ad alanina, tirosina alla fenilalanina). Tuttavia, la produzione e l'isolamento delle proteine ​​mutanti richiedono molto tempo. Come alternativa alla fase iniziale della ricerca, il concorso di peptide chinasi competitivo è semplice e conveniente. Qui descriviamo un protocollo per un test di concorrenza peptidico in vitro e per la convalida del sito di fosforilazione.