Дифференциация клеток регулируется множеством микроокружения факторов, в том числе как состав матрицы и материала подложки свойствами. Здесь мы опишем метод с использованием клеточных микрочипов в сочетании с тяговой силовой микроскопии для оценки как дифференцировки клеток и биомеханические клетки с субстратом взаимодействия как функция контекста микросреды.
Микроизготовленном клеточные микрочипы, которые состоят из контактных печатных комбинаций биомолекул на упругой поверхности гидрогеля, обеспечивают жестко контролируется, с высокой пропускной инженерно-технической системы для измерения влияния выстроенных биохимических сигналов на клеточной дифференцировки. Недавние усилия с использованием клеточных микрочипов продемонстрировали свою полезность для комбинаторных исследований, в которых многие микросреды факторы представлены параллельно. Тем не менее, эти усилия были сосредоточены в основном на изучении влияния биохимических реакций на сигналы клеток. Здесь мы представляем ячейки микрочипов платформу с настраиваемыми свойствами материала для оценки как дифференцировки клеток с помощью иммунофлуоресценции и биомеханические клеток-субстратного взаимодействия с тяговой силовой микроскопии. Для этого мы разработали два разных формата, использующие полиакриламидных гидрогелей различного модуля Юнга, изготовленную либо на предметные стекла микроскопа или стеклянным дном чашки Петри. Мы предоставляем BESт методы и способы их устранения для изготовления микрочипов на этих гидрогелевых субстратов, последующей клеточной культуры на микрочипы и получения данных. Эта платформа хорошо подходит для использования в исследованиях биологических процессов , для которых и биохимические (например, внеклеточный матрикс композиции) и биофизических (например, жесткость подложки) может играть кии существенным, пересекающиеся роли.
Взаимодействие между клетками и окружающими факторами микроокружения опосредует большое разнообразие биологических процессов , в ходе развития, гомеостаз, и болезни патогенез 1, 2, 3, 4. Эти микросреды взаимодействия включают доставку растворимых факторов для клеток, клеточную матрицу связывания и межклеточных взаимодействий посредством лиганд-рецепторного связывания. В дополнение к указанным выше биохимических соображений, биофизические параметры, такие как подложки механические свойства (например, модуль Юнга, пористость) и форма клеток, и связанным с ними вниз по течению механотрансдукция все чаще получили признание в качестве ключевых медиаторов клеточной дифференцировки 5, 6, 7, 8, 9 <sup>, 10. Сигналы, полученные в результате этих микроокружения взаимодействий служат в качестве входных данных для генных сетей и сигнальных путей. Кроме того, эти клеточные компоненты внутренней также обеспечивают обратную связь микросреды с помощью секретируемых факторов и разрушающих матрикс ферментов, завершая сложного взаимодействия регуляторная петля между сотовыми-характеристическая генетических программ и клеточных факторов микроокружения внешняя 5, 11, 12.
Использование инженерно – технических систем контролируемого представления микроокружения факторов, оказалась полезной в ряде различных контекстов 13, 14, 15. Микроизготовленном системы , в частности , способствовали точное пространственное структурирование белков и клеток, а также высоко распараллелен анализа с помощью миниатюризации 13, <supкласс = "Xref"> 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Клеточные микрочипы представляют одну такую микроизготовленном систему , в которой комбинации биомолекул контактных печатают на подложке с гидрогелем упругая полиакриламидном 23, 24, 25. Включение клеточных компонентов клея (а именно матричные белки) обеспечивает устойчивую клеточную адгезию и культуру на микрочипов, который часто следуют вниз по течению анализа через иммуноцитохимию и флуоресцентных репортеров. Клеточные микрочипы были продуктивно направлены на достижение более глубокому пониманию клеток печени фенотипа 23, 26, нервной дифференцировки предшественника 27, Mammarу прародителя судьба решения 28, эмбриональных стволовых клеток обслуживания / дифференцировки 23, 29, 30, легких метастазирование рака 31, и терапевтический ответ при меланоме 32. Недавно мы продемонстрировали использование клеточных микрочипов для определения роли внеклеточного матрикса (ЕСМ) белковой композиции в спецификации энтодермы 33, печень прародитель дифференцировки 34, 35, и опухоль легкого ответа препарат клеток 36. В этих работах, мы сосредоточились на расширении комбинаторных возможностей платформы массива и исследуя пересечения клеточной внутренней сигнализации с внеклеточной матрицы композиции и биомеханики. Кроме того, мы внедрили биофизических отсчеты в этой платформе массива, чтобы обеспечить возможность количественно характериterize роль клеток сократительной в дифференциации процессов 35. Для этого, мы интегрировали тяги силовой микроскопии (TFM) с клеточных микрочипов для проведения оценки высокой пропускной способности клеток генерируемых тяги. МТФ широко используется метод измерения клеточных сгенерированных тяговые силы и обеспечил значительное понимание в отношении координации одноклеточных и функции ткани уровня с составом и биомеханики местного микросреды 37, 38, 39, 40. Таким образом, сочетая МТФ с сотовыми микрочипов обеспечивает систему высокой пропускной способностью для измерения ключевых, физиологически соответствующих биофизических параметров.
Платформа ячейки микрочипов описана здесь состоит из четырех разделов: изготовление полиакриламидных подложек, изготовление решеток, культивировании клеток и анализа считывания и анализа данных. ВидетьНа рисунке 1 для схематического резюме первых трех опытных участков; На рисунке 2 схематично резюме заключительной секции с акцентом на анализе данных иммунофлюоресценции. Для того , чтобы адаптировать ячейки микрочипов платформу для исследований биомеханических взаимодействий клетки с субстратом, мы использовали полиакриламидных субстраты модуля Юнга перестраиваемого но подобной пористости, в Wen и др. 41. Для включения измерения TFM сил, оказываемого клеток на их подложке, мы реализовали со стеклянным дном Петри формата блюдо в дополнение к толстым предметные стекла микроскопа часто используемых другими группами. Таким образом, эта ячейка микрочипов платформа способна параллельных измерений клеточной дифференцировки с помощью иммунофлуоресценции на предметные стекла микроскопа и клеточных генерируемых сил через МТФ на отдельных стеклянным дном посуды. Мы также применили несколько улучшений аналитического подхода обычно используется с сотовыми микрочипов. SpecificalLY, вместо параметрического Z-озвучивания общей интенсивности острова, мы измеряем интенсивность одноклеточных и применять квантильной нормализации для того, чтобы учесть ненормальных распределений и более точно описать поведение сотовой связи. Мы считаем, что эти усовершенствования обеспечивают особую полезность в отношении исследований биологических процессов, в которых как биохимические и биофизические сигналы играют важную роль, пересекающиеся. Кроме того, наши аналитические улучшения возможности применения клеточных микрочипов для изучения целого ряда клеточных функций, для которых одноклеточный и поведение на уровне населения расходиться.
В наших экспериментах мы обнаружили, что наиболее распространенные ошибки связаны с качеством готовых массивов и плохо характеризуется отклик в биологической системе, представляющей интерес. Мы отсылаем читателя к таблице 1 для общих режимов отказа в клеточных микрочипов экспериментов и связанных с ними действий по устранению неполадок. Что касается качества массивов, в частности, мы рекомендуем следующее. Подтверждение технического качества и надежности выстроив программ, параметров и буферы с использованием флуоресцентно меченных молекул, таких как родамин-конъюгированного с декстраном. Тщательно очистите контакты до или после выстроив в соответствии с инструкциями изготовителя и дополнительно визуально проверить, что пин каналы очистить от мусора с помощью светового микроскопа. Подтвердите Arrayed сохранение биомолекулярная с использованием общих пятен белка или иммунноокрашивания. Следует отметить , что биомолекул с молекулярной массой ниже 70 кДа , которые часто не сохраняются в гидрогеле 23, </ SUP> 31. Проверка Arrayed биомолекулярная клеток-функциональность с использованием нескольких типов клеток. Обратите внимание, что только адгезивные клетки совместимы с массивами; Кроме того, адгезия к массивам зависит от обеих клеточных специфических свойств (например, интегрин профиль экспрессии) и выбранных белков ECM.
Из -за ограниченного пространства, мы не предусмотрели обширную обработку массива дизайна, верстка и изготовление здесь и отсылаем читателя к предыдущим работам 23, 25. Как правило , мы используем 100 выборочные подмассива (диаметр 150 мкм пятно, 450 мкм от центра до центра расстояния) , состоящие из 10-20 уникальных условий биомолекулы (например, 5-10 пятен / состояние). Число подмассивов в одном массиве изменяется в зависимости от количества биомолекул условий, представляющих интерес, которые могут быть удобно увеличенному до 1,280 на один 25 × 75 мм стекло микроскопа (~ 6,400 пятна в 64 подмассивов)Xref "> 25, 31 Параметры выше , будет в дальнейшем меняться в зависимости от размера рисунка интереса;. штырьки , способные генерировать шаблоны от 75 – 450 мкм , легко доступны.
Эксперименты с массивами лучше всего дополняют проверки высокой скоринговых выстроенных условий, представляющих интерес с использованием других форматов культуры, анализа считываний и систем биологической модели. В частности, мы рекомендуем дополнительно проверки влияния некоторых выстроенных условий с использованием массовых культур в сочетании со стандартными методами молекулярной биологии (например, QRT-ПЦР, иммуноблоттинга) или стандартного МТФ. Генетические манипуляции (например, нокдаун или избыточная экспрессия) фактора интереса в соответствующей биологической модели системы может также служить для подтверждения эффектов , наблюдаемых в массивах. В естественных условиях животные модели представляют собой еще одно средство проверки и недавно были использованы, например, чтобы подтвердить центральную роль галектина-3 и галектина-8рак легких метастатическим нишу, как это было первоначально идентифицированы с помощью микрочипов клеток 31, 49.
Ряд других методов были использованы для исследования микросреды регуляции клеточных функций, в том числе различных двумерных микроизготовленном систем 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 и трехмерных инженерных систем биоматериала 56, 57, 58 , 59, 60, 61. По сравнению с другими методами, особые преимущества ячейки микрочипов платформы, описанные здесь, включают в себя: (1) пропускной способностью досотни или тысячи различных комбинаций факторов, позволяющих анализ эффектов взаимодействия; (2) доступен, автоматизированный визуализации и анализа; (3) интеграция биохимических и биофизических считываниями с контролируемым представлением выстроенных факторов; (4) способность изменять свойства материала подложки; и (5) анализ одноклеточного высокого содержания судьбы и функции клеток.
Таким образом, сочетание клеточных микрочипов с МТФ на подложках жесткости перестраиваемый подложки позволяет тщательно характеристику биохимических и биофизических репликами. Как представлено здесь, эта платформа является обобщенным и может быть легко применен к различным адгезивных типов клеток и контекстов ткани в направлении улучшения понимания комбинаторной регуляции микросреды клеточной дифференцировки и механотрансдукции.
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем Остин Cyphersmith и Mayandi Sivaguru (Карл Р. Вёзе Институт геномных биологии, Университет штата Иллинойс в Урбана-Шампейн) за помощью микроскопии и великодушно размещения экрана и захвата видео в ядре микроскопии.
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100× penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22×60 mm coverglasses | Electron Microscope Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25×75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9–1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscope Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2000 ml | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |