Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.
Microfabricated cellulaire microarrays, die bestaan uit contact gedrukt combinaties van biomoleculen op een elastisch hydrogel oppervlak te strak, high-throughput systeem ontworpen om het effect van array biochemische signalen op celdifferentiatie. Recente inspanningen met behulp van mobiele microarrays hebben hun nut voor combinatorische studies waarin veel micro-omgeving factoren worden gepresenteerd in parallel aangetoond. Echter, deze pogingen voornamelijk gericht op het onderzoeken van de effecten van biochemische signalen op cel reacties. Hier presenteren we een cel microarray platform met instelbare materiaaleigenschappen gaan zowel celdifferentiatie door immunofluorescentie en biomechanische cel substraatinteracties door trekkracht microscopie. Hiervoor hebben we twee verschillende formaten gebruikmaking polyacrylamide hydrogels variërende elasticiteitsmodulus vervaardigd aan beide microscoopglaasjes of glazen bodem petrischalen ontwikkeld. Wij bieden best praktijken en het oplossen van problemen voor de fabricage van microarrays op deze hydrogel substraten, de daaropvolgende celcultuur op microarrays, en de overname van gegevens. Dit platform is zeer geschikt voor toepassing bij onderzoek naar biologische processen die zowel biochemische (bijvoorbeeld extracellulaire matrix compositie) en biofysische (bijvoorbeeld substraat stijfheid) signalen kunnen aanzienlijke spelen, snijdende rollen.
Interacties tussen cellen en micro-omgeving rondom factoren mediëren een grote verscheidenheid van biologische processen in ontwikkeling, homeostase en ziekte pathogenese 1, 2, 3, 4. Deze micro-omgeving interacties omvatten afgifte van oplosbare factoren aan cellen, cel-matrix binding en cel-cel interacties via ligand-receptorbinding. Naast bovengenoemde biochemische overwegingen biofysische parameters, zoals substraat mechanische eigenschappen (bijvoorbeeld modulus, porositeit) en celvorm en bijbehorende downstream mechanotransductie steeds erkenning gekregen als belangrijke mediatoren van celdifferentiatie 5, 6, 7, 8, 9 <sup>, 10. Signalen als gevolg van deze micro-omgeving interacties dienen als input voor gen-netwerken en signaalwegen. Bovendien zijn deze cel-intrinsieke componenten ook feedback aan de micro-omgeving door factoren en matrix-afbrekende enzymen, het invullen van een complex mederegulerende loop tussen cel-intrinsieke genetische programma en cel-extrinsieke factoren micromilieu 5, 11, 12.
Het gebruik van technische systemen voor gecontroleerde weergave van micro-omgeving factoren is nuttig gebleken in een aantal verschillende contexten 13, 14, 15. Microfabricated systemen hebben vooral nauwkeurige ruimtelijke patronen van eiwitten en cellen evenals zeer parallel verlopende analyse vergemakkelijkt via miniaturisatie 13, <supclass = "xref"> 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cel microarrays vertegenwoordigen zo'n microfabricated systeem waarin combinaties van biomoleculen contact gedrukt op een elastische polyacrylamide hydrogel substraat 23, 24, 25. De opname van cel-hechtende componenten (namelijk matrixeiwitten) maakt aanhoudende celadhesie en cultuur microarrays, die vaak gevolgd wordt door stroomafwaartse analyses via immunocytochemie en fluorescerende reporters. Cel microarrays zijn productief gericht op het bereiken van een beter begrip van de levercel fenotype 23, 26, neurale voorloper differentiatie 27, Mammary progenitor lot besluiten 28, embryonale stamcel onderhoud / differentiatie 23, 29, 30, 31 longkanker metastase en therapeutische respons in 32 melanoom. We hebben onlangs aangetoond dat het gebruik van mobiele microarrays voor de rol van extracellulaire matrix (ECM) eiwitsamenstelling in endoderm specificatie 33, leverprogenitor- differentiatie 34, 35 en longtumorcellijnen geneesmiddelrespons 36. In deze werken, hebben we ons gericht op de uitbreiding van de combinatorische mogelijkheden van de array-platform en het verkennen van de snijpunten van de cel-intrinsieke signalering met extracellulaire matrix compositie en biomechanica. Daarnaast hebben we biofysische uitlezingen uitgevoerd in deze array platform de mogelijkheid bieden om kwantitatief karakterize de rol van de cel contractiliteit in differentiatie verwerkt 35. Om dit te doen, geïntegreerd we trekkracht microscopie (TFM) met een mobiele microarrays om high-throughput evaluatie van de cel gegenereerd tractie mogelijk te maken. TFM is een algemeen gebruikte methode om cellen gegenereerde aandrijfkrachten meten en heeft belangrijke inzichten over de coördinatie van eencellige en weefsel functie op de samenstelling en biomechanica van de lokale micro-omgeving 37, 38, 39, 40 voorzien. Zo, een combinatie van TFM met mobiele microarrays zorgt voor een high-throughput-systeem voor het meten van de belangrijkste, fysiologisch relevante biofysische parameters.
De cel microarrayplatform hier beschreven bestaat uit vier delen: vervaardiging van polyacrylamide substraten fabricage van arrays, celkweek en assay uitlezen en analyseren van gegevens. ZienFiguur 1 een schematische samenvatting van de eerste drie experimentele punten; zie figuur 2 voor een schematisch overzicht van het laatste deel met een focus op de analyse van immunofluorescentie gegevens. Om de cel microarrayplatform studies van biomechanische cel- substraatinteracties passen, gebruikten we polyacrylamide substraten afstembare Young's modulus maar vergelijkbaar porositeit, per Wen et al. 41. Om TFM metingen van krachten uitgeoefend door cellen op hun substraat mogelijk voerden we een glazen bodem petrischaal format naast de dikke objectglaasjes vaak gebruikt door andere groepen. Zo, deze cel microarray platform is in staat om parallelle metingen van celdifferentiatie via immunofluorescentie op microscoopglaasjes en cel gegenereerde krachten via TFM op aparte glazen bodem gerechten. We hebben ook verschillende verbeteringen aangebracht op de analytische courante methode met een mobiele microarrays. specifically, in plaats van parametrische Z-scoring van de totale eiland intensiteit, meten we eencellige intensiteit en toe te passen kwantiel normalisatie om rekening te houden met niet-normale verdelingen en meer nauwkeurig te beschrijven cellulaire gedrag. Wij geloven dat deze verbeteringen te verstrekken bijzonder nut in de richting van onderzoek naar biologische processen waarin zowel biochemische en biofysische signalen spelen significant, snijdende rollen. Verder onze analytische verbeteringen maken de toepassing van cel microarrays studies van diverse cellulaire functies waarvoor eencellige en populatie niveau gedrag verschillen.
In onze experimenten hebben we gevonden dat de meest voorkomende fouten zijn gerelateerd aan de kwaliteit van de gefabriceerde arrays en slecht kenmerk reactie in het biologische systeem plaats. Wij verwijzen de lezer naar tabel 1 voor de gemeenschappelijke storingsmodi in cel microarray experimenten en bijbehorende stappen voor probleemoplossing. Ten aanzien van de kwaliteit van arrays in het bijzonder, raden wij u het volgende. Bevestigen de technische kwaliteit en de robuustheid van arraying's, parameters en buffers gebruikt fluorescerend gemerkte moleculen zoals rhodamine geconjugeerd dextran. Grondig reinigen pennen voor of na het rangschikken van de instructies van de fabrikant en verder visueel te controleren of de pin-kanalen zijn vrij van afval met behulp van een lichtmicroscoop. Bevestig gekleed biomolecuul retentie met behulp van algemeen eiwit vlekken of immunokleuring. Merk op dat biomoleculen met een molecuulgewicht lager dan 70 kDa vaak niet vastgehouden in de hydrogel 23, </ sup> 31. Valideren gekleed biomolecuul cell-functionaliteit met behulp van meerdere celtypen. Merk op dat alleen hechtende cellen geschikt arrays; bovendien, hechting aan matrices afhankelijk van zowel cel-specifieke eigenschappen (bijvoorbeeld integrine expressieprofiel) en de geselecteerde ECM eiwitten.
Vanwege de beperkte ruimte, hebben we niet voorzien van een uitgebreide behandeling van de array ontwerp, de indeling en fabricage hier en verwijzen de lezer naar de vorige werkt 23, 25. Wij gebruiken over het algemeen 100 spot subarrays (150 micrometer spot diameter van 450 micrometer hart-op-hart afstand), bestaande uit 10-20 unieke biomolecuul zijn uitgevoerd (5-10 vlekken / conditie). Het aantal subarrays in een matrix is afhankelijk van het aantal biologische molecule voorwaarden plaats, die comfortabel tot 1280 worden geschaald op een 25 x 75 mm objectglaasje (~ 6400 spots in 64 subarrays)xref "> 25, 31 de parameters hierboven verder afhankelijk van de patroongrootte plaats;. pinnen kunnen genereren patronen 75-450 urn zijn beschikbaar.
Array experimenten worden best aangevuld met validatie van hoog scorende gekleed omstandigheden van belang het gebruik van andere cultuur formats, assay uitlezingen, en biologische modelsystemen. In het bijzonder, raden we verder valideren effecten van geselecteerde gekleed omstandigheden met behulp van bulk culturen in combinatie met standaard moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld qRT-PCR, immunoblotting) of standaard TFM. Genetische manipulatie (bijv knock-down of overexpressie) van de factor van belang in een geschikte biologische modelsysteem kan ook dienen om effecten waargenomen in arrays te bevestigen. In vivo diermodellen vertegenwoordigen een ander middel voor validatie en werden onlangs gebruikt, bijvoorbeeld, de centrale rol van galectine-3 en galectine-8 bevestigtde longkanker metastatische niche, zoals aanvankelijk geïdentificeerd via de mobiele microarray 31, 49.
Een aantal andere methoden zijn gebruikt om micro-omgeving regulatie van cellulaire functies, waaronder een verscheidenheid aan tweedimensionale microvervaardigde systemen 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 en driedimensionale engineered biomateriaal systemen 56, 57, 58 probe , 59, 60, 61. In vergelijking met andere werkwijzen, de bijzondere voordelen van de cel microarrayplatform beschreven omvatten: (1) tot doorvoerhonderden of duizenden verschillende combinaties van factoren, waardoor analyse van de interactie-effecten; (2) toegankelijk, geautomatiseerde beeldvorming en analyse; (3) integratie van beide biochemische en biofysische uitlezingen met gecontroleerde presentatie van gekleed factoren; (4) het vermogen om substraat materiaaleigenschappen variëren; en (5) met hoge gehalte single-cell analyse van het lot van de cel en functie.
Samengevat, de combinatie van cel microarrays met TFM op substraten afstembare substraat stijfheid maakt grondige karakterisatie van zowel biochemische en biofysische cues. Zoals hier gepresenteerde dit platform generaliseerbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van hechtende celtypen en weefsels context naar een beter begrip van combinatorische micro-omgeving regulering van celdifferentiatie en mechanotransductie.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen Austin Cyphersmith en Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign) voor hulp bij microscopie en voor royaal opvang scherm en video-opname op de microscopie kern.
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100× penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22×60 mm coverglasses | Electron Microscope Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25×75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9–1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscope Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2000 ml | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |