Summary

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Published: March 16, 2017
doi:

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

La placenta è il primo organo di sviluppare durante l'embriogenesi ed è necessario per la sopravvivenza dell'embrione in via di sviluppo. La placenta comprende numerose cellule trofoblastiche che differenziano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali di blastocisti preimpianto. Come tale, la nostra comprensione dei primi eventi di differenziazione della placenta umana è limitata a causa delle restrizioni etiche e legali su l'isolamento e la manipolazione di Embriologia Umana. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono un sistema robusto modello per lo studio dello sviluppo umano e possono anche essere differenziate in vitro in cellule trofoblastiche che esprimono i marcatori dei vari tipi di cellule trofoblasto. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare hPSCs in cellule trofoblastiche utilizzando morphogenic proteina ossea 4 e gli inibitori delle vie di segnalazione / nodali activin. Questo protocollo genera vari tipi di cellule trofoblastiche che possono essere transfettate con siRNAper indagare la perdita di funzione fenotipi o possono essere infettati da agenti patogeni. Inoltre, hPSCs possono essere modificati geneticamente e poi differenziate in progenitori trofoblasto per guadagno-di-funzione analizza. Questo vitro metodo di differenziazione per la generazione di trofoblasto umano a partire dalle hPSCs supera le limitazioni etiche e legali di lavorare con i primi embrioni umani, e questo sistema può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui la scoperta di farmaci e ricerca sulle cellule staminali.

Introduction

La placenta è necessario per la crescita e la sopravvivenza del feto durante la gravidanza e facilita lo scambio di gas, sostanze nutritive, prodotti di scarto, e gli ormoni tra la circolazione materna e fetale. Il primo organo formato durante l'embriogenesi dei mammiferi è la placenta, che inizia lo sviluppo 6-7 giorni dopo il concepimento nell'uomo e 3,5-4,5 giorni nel topo 1, 2, 3, 4. cellule trofoblastiche sono le cellule più importanti della placenta, e queste cellule rappresentano uno dei primi eventi di differenziazione lignaggio dell'embrione di mammifero. Essi derivano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali esterni della blastocisti preimpianto. La nostra conoscenza delle prime fasi di sviluppo placentare è limitata da restrizioni etiche e logistiche sulla modellazione precoce sviluppo umano.

Durante embrionali impianto, trofoblastoinvadono l'epitelio materna e differenziarsi in cellule progenitrici specializzate 5. Citotrofoblasti (CTBS) sono mononucleate, progenitori indifferenziati che si fondono e si differenziano in sinciziotrofoblasti (SYN) e trofoblasto invasive extravilloso (EVTS), che ancorano la placenta all'utero. SYN sono multinucleate, cellule terminalmente differenziate che sintetizzano gli ormoni necessari per sostenere la gravidanza. Gli eventi di differenziazione primi che generano EVTS e SYN sono essenziali per la formazione della placenta, come menomazioni in cellule trofoblastiche risultato in aborto spontaneo, pre-eclampsia e restrizione della crescita intrauterina 1. I tipi di linee cellulari umane trofoblasto che sono stati sviluppati includono immortalati CTBS e coriocarcinoma, che producono ormoni della placenta e di visualizzazione proprietà invasive 6. cellule trofoblastiche primari da placenta primo trimestre umani possono essere isolati, ma le cellule rapidamente differentiate e smettere di proliferare in vitro. È importante sottolineare che, trasformato e linee cellulari primarie avere diversi profili di espressione genica, indicando che le linee cellulari tumorali trofoblasto e immortalate potrebbero non rappresentare accuratamente trophoblasts primarie 7. Inoltre, queste linee sono improbabili per assomigliare placentare trofoblasto progenitori di cellule staminali, perché sono derivati ​​da dopo-prima fase attraverso trimestre terzi.

Vi è la necessità di un robusto nel sistema di coltura in vitro di trofoblasto umano nella fase iniziale, al fine di studiare gli eventi precoci della formazione e della funzione placentare. le cellule staminali embrionali umane (hESC), che condividono gli oggetti con massa cellulare interna dell'embrione preimpianto, sono spesso utilizzati per modellare precoce sviluppo umano, compresa la formazione dei primi placenta. Entrambe le cellule indotte umane pluripotenti staminali (hiPSCs) e hESC possono essere differenziati in trofoblasto in vitro su Bone MorProtein phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Questa conversione di cellule pluripotenti cellule trofoblastiche utilizzando BMP4 è specifico per le cellule umane ed è ampiamente usato per studiare lo sviluppo dei primi placenta umana in quanto non richiede l'accesso a embrioni umani 9, 16. Recentemente, si è scoperto che l'aggiunta di inibitori A83-01 (A) e PD173074 (P), che bloccano le vie di segnalazione SMAD2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta l'efficienza della differenziazione HPSC in progenitori trophectoderm simili, soprattutto SYNs e EVTS, senza la vasta generazione di mesoderma, endoderma, o cellule ectoderma 9, 17 </sup>. Utilizzando queste condizioni medie, hESC differenziato per 12 giorni hanno simili profili di espressione genica le cellule trophectoderm isolate da embrioni blastocisti-stadio umano e secernono vari ormoni della crescita specifici placentare, sostenere la validità di questo sistema modello in vitro 9, 11. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la differenziazione in vitro di hPSCs in progenitori trofoblasto umani utilizzando BMP4 / A / P terreno di coltura. Queste condizioni producono numero abbondante di cellule per un'ampia varietà di applicazioni, tra RNA sequenziamento, gene perturbazione utilizzando siRNAs, infezioni patogeni e modificazione genetica utilizzando trasfezione lipofezione-mediata.

Protocol

NOTA: Per la differenziazione delle hESC sia o hiPSCs in progenitori trofoblasto, hPSCs coltivati ​​su fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono la transizione a alimentatore-Free condizioni per due passaggi prima di iniziare la differenziazione con BMP4 / A / P. Questo processo elimina la contaminazione MEF di cellule differenziate. Qui, vi presentiamo un protocollo per la differenziazione hESC, e lo stesso protocollo può essere applicato a hiPSCs. 1. Cultura e recupero di hESC su irradiati fibroblasti embri…

Representative Results

Panoramica di differenziazione in vitro di hPSCs Questo protocollo di differenziazione in vitro inizia con hESC indifferenziato coltivati in MEF che la transizione al alimentatore-Free condizioni per un passaggio (Figura 1A). Mentre abbiamo descritto la differenziazione di hESC in questo protocollo, abbiamo usato questo protocollo di differenziarsi con successo hiPSCs in cellule trofoblastiche. …

Discussion

Abbiamo presentato i passaggi fondamentali per differenziare hESC in progenitori trofoblasto. Questo protocollo è stato recentemente ottimizzato per differenziare rapidamente hESCs con l'aggiunta di inibitori Activin / segnalazione nodale, aumentando la differenziazione di cellule trofoblastiche ed evitando la generazione di progenitori mesoderma, tipicamente osservati con il solo trattamento BMP4. Il sistema modello BMP4 consente per l'esame delle prime fasi della specifica trofoblasto stirpe umana e di espans…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

DMEM/F12 Invitrogen 11330-057
Knock Out Serum Replacement Invitrogen 10828-028 This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA Invitrogen 11140-050
FBS Invitrogen 16000-044
L-Glutamine Invitrogen 10828-028
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-155
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
B-FGF Millipore GF-003
DMEM Invitrogen 11965-118
Dispase Invitrogen 17105-041
Collagenase Type IV Invitrogen 17104-019
Rock inhibitor Y27632 Calbiochem 688000
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem 6001G MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter Millipore SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator Heracell/VWR 89187-192 Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4 R&D Systems 314-BP-01M
A 83-01 R&D Systems 2939/10
PD173074 R&D Systems 3044/10
RNAiMax Invitrogen 13778150
Trizol ThermoFisher 15596026 Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001
Matrigel Corning 356231 This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

Referencias

  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Play Video

Citar este artículo
Wang, J., Anguera, M. C. In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells. J. Vis. Exp. (121), e55268, doi:10.3791/55268 (2017).

View Video