La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

La placenta è necessario per la crescita e la sopravvivenza del feto durante la gravidanza e facilita lo scambio di gas, sostanze nutritive, prodotti di scarto, e gli ormoni tra la circolazione materna e fetale. Il primo organo formato durante l'embriogenesi dei mammiferi è la placenta, che inizia lo sviluppo 6-7 giorni dopo il concepimento nell'uomo e 3,5-4,5 giorni nel topo ^{1, 2, 3, 4.} cellule trofoblastiche sono le cellule più importanti della placenta, e queste cellule rappresentano uno dei primi eventi di differenziazione lignaggio dell'embrione di mammifero. Essi derivano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali esterni della blastocisti preimpianto. La nostra conoscenza delle prime fasi di sviluppo placentare è limitata da restrizioni etiche e logistiche sulla modellazione precoce sviluppo umano.

Durante embrionali impianto, trofoblastoinvadono l'epitelio materna e differenziarsi in cellule progenitrici specializzate ^5. Citotrofoblasti (CTBS) sono mononucleate, progenitori indifferenziati che si fondono e si differenziano in sinciziotrofoblasti (SYN) e trofoblasto invasive extravilloso (EVTS), che ancorano la placenta all'utero. SYN sono multinucleate, cellule terminalmente differenziate che sintetizzano gli ormoni necessari per sostenere la gravidanza. Gli eventi di differenziazione primi che generano EVTS e SYN sono essenziali per la formazione della placenta, come menomazioni in cellule trofoblastiche risultato in aborto spontaneo, pre-eclampsia e restrizione della crescita intrauterina ^1. I tipi di linee cellulari umane trofoblasto che sono stati sviluppati includono immortalati CTBS e coriocarcinoma, che producono ormoni della placenta e di visualizzazione proprietà invasive ^6. cellule trofoblastiche primari da placenta primo trimestre umani possono essere isolati, ma le cellule rapidamente differentiate e smettere di proliferare in vitro. È importante sottolineare che, trasformato e linee cellulari primarie avere diversi profili di espressione genica, indicando che le linee cellulari tumorali trofoblasto e immortalate potrebbero non rappresentare accuratamente trophoblasts primarie ^7. Inoltre, queste linee sono improbabili per assomigliare placentare trofoblasto progenitori di cellule staminali, perché sono derivati ​​da dopo-prima fase attraverso trimestre terzi.

Vi è la necessità di un robusto nel sistema di coltura in vitro di trofoblasto umano nella fase iniziale, al fine di studiare gli eventi precoci della formazione e della funzione placentare. le cellule staminali embrionali umane (hESC), che condividono gli oggetti con massa cellulare interna dell'embrione preimpianto, sono spesso utilizzati per modellare precoce sviluppo umano, compresa la formazione dei primi placenta. Entrambe le cellule indotte umane pluripotenti staminali (hiPSCs) e hESC possono essere differenziati in trofoblasto in vitro su Bone MorProtein phogenic 4 (BMP4) ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Questa conversione di cellule pluripotenti cellule trofoblastiche utilizzando BMP4 è specifico per le cellule umane ed è ampiamente usato per studiare lo sviluppo dei primi placenta umana in quanto non richiede l'accesso a embrioni umani ^{9, 16.} Recentemente, si è scoperto che l'aggiunta di inibitori A83-01 (A) e PD173074 (P), che bloccano le vie di segnalazione SMAD2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta l'efficienza della differenziazione HPSC in progenitori trophectoderm simili, soprattutto SYNs e EVTS, senza la vasta generazione di mesoderma, endoderma, o cellule ectoderma ^{9, 17} </sup>. Utilizzando queste condizioni medie, hESC differenziato per 12 giorni hanno simili profili di espressione genica le cellule trophectoderm isolate da embrioni blastocisti-stadio umano e secernono vari ormoni della crescita specifici placentare, sostenere la validità di questo sistema modello in vitro ^{9, 11.} Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la differenziazione in vitro di hPSCs in progenitori trofoblasto umani utilizzando BMP4 / A / P terreno di coltura. Queste condizioni producono numero abbondante di cellule per un'ampia varietà di applicazioni, tra RNA sequenziamento, gene perturbazione utilizzando siRNAs, infezioni patogeni e modificazione genetica utilizzando trasfezione lipofezione-mediata.