Summary

Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas

Published: March 23, 2017
doi:

Summary

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Abstract

Preparación de la muestra es la clave para la detección y visualización de analitos en experimentos de láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) óptima. Determinar el protocolo apropiado para seguir todo el proceso de preparación de la muestra puede ser difícil, ya que cada paso debe ser optimizada para cumplir con las características únicas de los analitos de interés. Este proceso no sólo consiste en encontrar una matriz compatible que puede desorber e ionizar las moléculas de interés de manera eficiente, sino también la selección de la técnica de deposición de matriz apropiada. Por ejemplo, una técnica de deposición de matriz húmeda, lo que implica la disolución de una matriz en un disolvente, es superior para la desorción de la mayoría de proteínas y péptidos, mientras que las técnicas de deposición de matriz seca son particularmente eficaces para la ionización de los lípidos. Sublimación ha sido reportado como un método altamente eficaz de la deposición de matriz seca para la detección de lípidos en el tejido por MALDI IMS debido a la homogeneity de la deposición de cristales de la matriz y la deslocalización mínimo analito en comparación con muchos métodos de deposición húmeda 1, 2. En términos generales, se trata de la colocación de una muestra y de la matriz en polvo en una cámara sellada al vacío con las muestras prensadas contra una superficie fría. El aparato es bajado a continuación en un baño calentado (arena o aceite), lo que resulta en la sublimación de la matriz en polvo sobre la superficie de muestra de tejido enfriado. Aquí se describe un protocolo de sublimación usando 1,5-diamino-naftaleno matriz (DAN) para la detección y visualización de los gangliósidos en el cerebro de rata utilizando MALDI IMS.

Introduction

Asistida por matriz de desorción láser / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) se está convirtiendo en un codiciado técnica para la visualización de la distribución espacial de los lípidos, péptidos y proteínas a través de superficies de muestras intactas. MALDI IMS era conocido previamente como una técnica analítica para analitos pre-purificado, pero en los últimos años, se ha llamado la atención en muchas otras disciplinas debido a la capacidad de combinar la exactitud de la espectrometría de masas con puntos de referencia de alta resolución visuales / anatómicas sin la necesitará para cualquier etiquetado externo. Como la piscina científica de los investigadores que utilizan esta técnica sigue creciendo, hay una mayor necesidad de protocolos estandarizados y fáciles de seguir para ayudar en el desarrollo y optimización de experimentos IMS. Los gangliósidos, un grupo de lípidos de membrana muy abundantes en el sistema nervioso central, son ideales para experimentos de MALDI IMS como su ubicación, incrustado dentro de la membrana, hace cierta especificidadit imposible detectar el uso de Inmuno-etiquetado convencional. Además, hemos demostrado, usando MALDI IMS, que estos lípidos, que funcionan como moduladores de la señalización celular, entre otras cosas, tienen patrones de distribución anatómica únicas en el cerebro de roedores sanos que son alterados después de la lesión cerebral 3, 4, 5. Los gangliósidos se encuentran en un intervalo de masa superior en comparación con la mayoría de las especies de lípidos, y son por lo tanto más adaptado a la plataforma de imágenes MALDI.

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo de MALDI IMS experimento. Diagrama del flujo de trabajo general de un experimento de MALDI IMS usando sublimación. El tejido congelado a -80 ° C se secciona en un criostato y 10 micras secciones son deshielo montado en portaobjetos de ITO conductores. El portaobjetos se coloca entonces en un desecador hasta la sublimación. SLIdes se inserta en el aparato de sublimación y se aplica una capa uniforme de la matriz a la superficie de la muestra de tejido. Las muestras se congelaron durante la noche en un congelador C -20 ° después se colocaron en un desecador durante 10 min. Una vez que se han aplicado las normas, las muestras se insertan en el instrumento MALDI donde un láser se dirige a través del tejido causando moléculas desorbidos en la matriz para ionizar. Los iones viajan por un tubo de vuelo y por separado en función de su masa (/ TOF tiempo-de-vuelo) hasta que alcanzan el detector. La información sobre la abundancia iónica de analitos dentro de un rango predeterminado de masa a carga (m / z) se muestra como tanto una imagen molecular y espectro de masas. Estos datos se pueden usar tanto para visualizar y cuantificar la abundancia iónica del analito de interés en el tejido de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

preparación de la muestrapor MALDI IMS es muy variable, ya que cada paso del proceso debe ser personalizado para los analitos de interés. La característica definitoria de experimentos basados ​​en MALDI es el uso de un revestimiento de matriz depositada sobre la superficie de la muestra antes del análisis. Además de la función de absorber y transferir energía de radiación del láser durante el proceso de ablación, la matriz también sirve para aislar diversos analitos de la muestra, lo que facilita el análisis de los compuestos de interés 6, 7. una aplicación homogénea de la matriz a la superficie de la muestra es el paso más importante en el proceso de preparación de la muestra. La deposición de matriz incorrecta puede dar lugar a grandes formaciones heterogéneas cristal matriz y el desarrollo de artefactos, bajo la señal de iones, y la mala reproducibilidad 7.

Debido a la afinidad de ciertas matrices para aislar analitos específicos, el tipo de matriz seleccionado para un experimento puedealterar de manera significativa el resultado. Las matrices utilizadas para la obtención de imágenes de proteínas y péptidos a menudo difieren de las utilizadas para los lípidos de formación de imágenes y el proceso se complica aún más por la necesidad de procedimientos adicionales, tales como lavado y rehidratación pasos con el fin de detectar con éxito las señales a partir de tejido. Aunque existen etapas de lavado para la mejora de las señales de lípidos 8, no son un requisito previo para la detección de la mayoría de especies de lípidos. Al seleccionar una matriz para un experimento de formación de imágenes de lípidos, es importante tener en cuenta la polaridad de los lípidos de interés, ya que esto reducir la gama de matrices adecuadas. Por ejemplo, los gangliósidos contienen residuos de ácido siálico que les dan una polaridad negativa global. Hay una serie de matrices que pueden desorber e ionizar gangliósidos a partir de tejido de manera efectiva; Sin embargo, factores tales como picos derivadas de la matriz en el espectro y la estabilidad de la matriz al vacío deben ser tomados en consideración. 1,5-diaminonaftaleno (DAN) de la matriz es lo suficientemente estable en condiciones de vacío instrumento para la mayoría de aplicaciones de imágenes y ha demostrado un alto grado de sensibilidad para la desorción de los lípidos y se puede utilizar para el análisis de lípidos en ambos modos de iones positivos y negativos 2. matriz DAN, en comparación con otras matrices de afinidad de lípidos negativos tales como el ácido dihidroxibenzoico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), y 5-cloro-2-mercaptobenzotiazol (CMBT), fue capaz de desorber más eficiente gangliósidos de cerebro de rata tejido en el modo de ion negativo (manuscrito en preparación).

Al seleccionar el método adecuado para la deposición de matriz es de igual importancia para la selección de la propia matriz. métodos de deposición de matriz húmeda en el que la matriz sólida se disuelve en un disolvente orgánico, y se depositan por neumático o pulverizadores o observadores automatizado, son particularmente eficaces para la desorción de proteínas y péptidos como el líquido impregna la muestra para permitir adicionalcción de compuestos y co-cristalización con la matriz. Aunque estas técnicas también se pueden utilizar para aplicaciones de lípidos, la deslocalización analito y formaciones de cristal de matriz desigual son sucesos comunes, debido a la gran abundancia y la solubilidad de los lípidos en disolventes, en particular en el tejido 2, 9. Debido a que los lípidos se ionizan fácilmente a partir de tejidos, técnicas de deposición de matriz secos, como sublimación, ofrecen una alternativa sencilla y rentable para pulverizadores eludiendo las disposiciones que muchos de los inconvenientes de estas técnicas. El éxito de la sublimación en experimentos MALDI IMS se atribuye a características tales como la morfología de la matriz microcristalina lo que aumenta el área superficial para la matriz de unión a analito, el aumento de la pureza de la matriz, y la deposición de matriz homogénea que conducen a una mayor reproducibilidad en comparación con las técnicas de matriz húmeda 1, 10.

invo sublimaciónLves calentamiento de una matriz de polvo bajo vacío inmediatamente por debajo de una superficie de la muestra enfriada resultante en forma sólida a la transición de fase gaseosa de la matriz en polvo seguido de la deposición sobre la superficie de la muestra de tejido. Durante la sublimación, deposición de la matriz puede ser controlado por factores variables tales como el tiempo, la temperatura y la presión para proporcionar resultados altamente reproducibles. Un experimento de la sublimación solo puede tomar de 5 a 20 minutos, dependiendo del tipo de matriz seleccionada, que puede ser reutilizado varias veces antes de su eliminación. El aparato puede ser comprado comercialmente a una fracción del precio de los pulverizadores automáticos y es fácilmente desmontado para su limpieza y mantenimiento. El bajo costo y la simplicidad relativa de esta técnica de deposición de la matriz, lo hacen ideal para los investigadores que comienzan o en expansión en aplicaciones de imágenes de lípidos en MALDI IMS. Aunque la información que detalla los protocolos para la sublimación de los tejidos para IMS se han reportado 11, unos protocolos estandarizados existen which centrarse en el flujo de trabajo básico involucrado en la realización de un experimento de la sublimación para obtener imágenes de los lípidos de alto peso en el modo de iones negativos, por lo que es difícil establecer la técnica sin un amplio ensayo y error. El siguiente es un protocolo experimental con el objetivo de llenar ese hueco para la sublimación de la matriz de DAN en secciones de cerebro de rata para la formación de imágenes de alta resolución y detección de los gangliósidos.

Figura 2
Figura 2: Aparato de sublimación. La fotografía (A) y el diagrama esquemático (B) del aparato de sublimación. La bomba de vacío está conectada por un tubo de goma a una trampa fría llena con 300 ml de etanol. La trampa está entonces conectada por un tubo de goma al aparato de sublimación. El aparato se compone de dos piezas separadas de material de vidrio que están sellados juntos con un metal U-articulación. La mitad superior de la sublimadorcontiene el condensador que está lleno de aguanieve hielo. La placa de muestra se pega sobre la parte inferior del condensador, en el interior del aparato de vidrio sellado. La mitad inferior del aparato de sublimación contiene la matriz DAN, que se extiende de manera uniforme hacia la placa de muestra. Durante la sublimación, el aparato de vidrio se coloca en un baño de arena se calienta a 140 ° C por una placa caliente directamente debajo de ella. La sonda de temperatura ayuda a mantener una temperatura estable durante todo el experimento sublimación través de la retroalimentación de la temperatura del baño de arena en comparación con la temperatura predeterminada para el experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los procedimientos de manejo de animales describen a continuación se adhieren a la Universidad de Cuidado de Animales de Ontario Occidental (2016-014). 1. Preparación del tejido y Seccionamiento Extraer el tejido cerebral de la rata a través de un proceso conocido como "fresco congelado Extraction" (FFE). La eutanasia a las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico y controlar los reflejos en las extremidades. Una vez que todos los reflejos han …

Representative Results

Al finalizar el experimento sublimación, las dos mitades del aparato de vidrio se separan en la campana de humos y la corredera, pegado en el condensador, se pueden eliminar (Figura 3A). En este punto, la corredera debe ser examinado para la distribución desigual de la matriz y el tiempo, la temperatura o la colocación del aparato en el baño de arena puede tener que ser ajustado para la siguiente diapositiva. Un exitoso experimento sublimación DAN resultará en una …

Discussion

Este trabajo detalla un protocolo estandarizado de la sublimación de la matriz en el tejido para la detección de lípidos cargados negativamente, tales como gangliósidos, en los experimentos de MALDI IMS. Preparación de muestras para MALDI IMS es muy variable y debe ser personalizado para adaptarse a las propiedades únicas de analito de interés. La aplicación de la matriz sobre la superficie de la muestra de tejido es un aspecto crucial del proceso de preparación de la muestra con respecto a la calidad de los re…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Université de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Materials

Sublimator Chemglass Life Sciences CG3038-01
1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix Sigma-Aldrich D21200  100 G
Cryostat Thermo-Fisher Scientific CryoStar NX50
Hot plate with temperature feedback Thermo-Fisher Scientific HP88857290 Isotemp ADVD 7×7 HP 100-120v
Stainless Steel Jack Thermo-Fisher Scientific 2216479 10×10
Cold Trap Custom built on site
Vacuum Pump Franklin Electric 1102180403 Savant VP100 Two Stage
Indium-tin-oxide (ITO) Slides Hudson Surface Technology PSI 1111000 type II, 1.1mm/25 each
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument AB Sciex
Desiccator Sigma-Aldrich D2797 tabletop desiccator

Referencias

  1. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
  2. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
  3. Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
  4. Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
  5. Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
  6. Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
  7. Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
  8. Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
  9. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
  10. Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
  11. O’Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
  12. Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
  13. Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
  14. Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
  15. Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
  16. Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
  17. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
  18. Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).

Play Video

Citar este artículo
Caughlin, S., Park, D. H., Yeung, K. K., Cechetto, D. F., Whitehead, S. N. Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (121), e55254, doi:10.3791/55254 (2017).

View Video