Summary

MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

Published: March 23, 2017
doi:

Summary

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Abstract

샘플 준비는 최적의 검출 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 이미징 질량 분석 (IMS) 실험 분석의 시각화를위한 열쇠입니다. 각 단계는 관심있는 분석의 고유 한 특성에 적합하도록 최적화해야합니다으로 샘플 준비 과정을 통해 수행 할 수있는 적절한 프로토콜을 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 프로세스는 탈착 효율적 관심 분자를 ​​이온화 할 수있는 호환 가능한 행렬을 발견 할뿐만 아니라 적절한 매트릭스 증착 기술을 선택하지 포함한다. 건조 매트릭스 증착 기술은 지질의 이온화에 특히 효과적인 반면, 예를 들어 용매에 용해 매트릭스를 수반 행렬 습식 증착 기술은, 대부분의 단백질 및 펩티드의 탈착 우수하다. 승화 인해 homogenei MALDI IMS에 의해 조직 내 지질의 검출 용 드라이 매트릭스 증착하는 매우 효율적인 방법으로보고되어왔다매트릭스 액정 증착 최소 분석 비국 재화의 TY 많은 습식 증착 방법 1, 2에 비해. 대체로, 그것은 차가운 표면에 가압 샘플과 진공 밀봉 챔버에서 샘플 가루 행렬을 배치하는 것을 포함한다. 장치는 냉각 된 조직 샘플의 표면 상에 분말 형 행렬의 승화 결과, 가열 조 (모래 또는 기름)으로 저하된다. 여기에서 우리는 MALDI IMS를 사용하여 쥐의 뇌에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 1,5- 디아 미노 (DAN) 매트릭스를 사용하여 승화 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 이미징 질량 분석 (IMS)되고 고도로 추구 그대로 샘플 표면에 걸쳐 지질, 펩타이드 및 단백질의 공간적 분포의 시각화를위한 기술 후. MALDI IMS는 이전에 미리 정제의 분석을위한 분석 기술로 알려져 있지만, 최근에는, 그 때문에없이 고해상도 영상 / 해부학 적 기준점과 질량 분석의 정확성을 결합 할 수있는 능력의 많은 분야에서 주목을 받고있다 외부 표시를 위해 필요합니다. 이 기술을 이용하여 연구의 과학적 풀 성장을 계속하기 때문에, IMS 실험의 개발 및 최적화를 지원하기 위해 표준화되고 쉽게 추적 프로토콜에 대한 필요성이 증가된다. 강글리오사이드, 중추 신경계에서 매우 풍부한 세포막 지질 그룹 멤브레인 내에 내장의 위치뿐만 MALDI IMS 실험 이상적은 특정하게 정시기존의 면역 라벨을 사용하여 탐지하는 것은 불가능 말이지. 또한, 우리는 세포 신호 전달의 조절 자로서 기능이 지질은, 다른 것들 중에서도, 뇌 손상 3, 4, 5 이후에 변경된다 건강한 쥐 뇌 고유의 해부학 적 분포 패턴을 가지고, MALDI IMS를 사용하여 도시 하였다. 강글리오사이드는 대부분 지질 종에 비해 더 높은 질량 범위에 위치하고, 따라서 MALDI 이미징 플랫폼에 가장 적합한다.

그림 1
그림 1 : MALDI IMS 실험의 워크 플로우. 승화를 사용하여 MALDI IMS 실험의 일반적인 워크 플로 다이어그램. -80 ° C에서 냉동 조직은 저온 유지 장치로 구분되며, 10 μm의 섹션은 해동 전도성 ITO 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드는 다음 승화 될 때까지 데시 케이 터에 배치됩니다. SLI는DES는 승화 장치에 삽입하고 행렬의 짝수 층은 조직 샘플의 표면에 도포된다. 시료를 10 분 동안 데시 케이 터에 배치 된 -20 ℃ 냉동고에서 밤새 동결. 기준이 적용 되었다면, 시료에 레이저가 이온화 매트릭스 분자의 이탈을 야기하는 조직을 가로 질러 지향되는 MALDI 기기에 삽입된다. 이온은 검출기에 도달 할 때까지 자신의 질량 (비행 시간 형 / TOF)을 기반으로 비행 튜브와 분리를 이동한다. 소정의 질량 – 대 – 전하 (m / z) 범위 내에서 분석의 이온 풍요 로움에 대한 정보는 분자 영상과 질량 스펙트럼 모두로 표시됩니다. 이 데이터는 시각화 영상화 조직 내의 관심 분석 물질의 이온 풍부 정량화 모두에 사용될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

샘플 준비프로세스의 각 단계는 관심의 분석에 정의해야합니다으로 MALDI IMS에 대한 높은 변수입니다. MALDI 기반 실험의 정의 기능은 분석하기 전에 샘플 표면 상에 증착 된 코팅 기질의 사용이다. 흡수 및 제거 프로세스 중에 레이저로부터 방사 에너지를 전달하는 역할 이외에도, 상기 매트릭스는 또한 그에 대한 관심 (6, 7)의 화합물의 분석을 용이하게 샘플로부터 여러 분석 물을 분리하는 역할을한다. 시료 표면에 대한 매트릭스의 균질 한 애플리케이션은 시료 준비 과정에서 가장 중요한 단계이다. 부적절한 매트릭스 증착은 큰 이종 매트릭스 결정 형성과 유물의 개발, 낮은 이온 신호와 가난한 재현성 7로 이어질 수 있습니다.

특정 매트릭스의 친화 특정 분석 물을 분리하기 위하여, 행렬의 형태는 실험 선정 인해 수상당히 결과를 변경. 단백질 및 펩티드의 이미징에 사용되는 기질은 종종 촬상 지질에 사용되는 것과 상이하고, 처리는 또한 그러한 성공적 조직으로부터의 신호를 검출하기 위해 세척 및 재수 화 단계와 같은 추가의 절차에 대한 필요성에 의해 복잡해진다. 세척 단계는 지질 신호 (8)의 향상을 위해 존재하지만, 이들은 대부분 지질 종의 검출을위한 전제 조건 아니다. 지질 이미징 실험의 매트릭스를 선택하는 경우, 적합한 행렬의 범위를 좁히는 것 등이 주목 지질의 극성을 고려하는 것이 중요하다. 예를 들어, 강글리오사이드는 그들에게 전반적으로 부정적인 극성을 제공 시알 산 잔기를 포함한다. 효과적으로 탈착 및 조직으로부터 강글리오사이드를 이온화 수 행렬들이있다; 그러나, 스펙트럼 진공하에 매트릭스의 안정성 행렬 유래의 피크와 같은 요인을 고려하에 수행되어야한다. 1,5-diaminonapthalene (DAN) 행렬 이미징 애플리케이션의 대부분의 악기 진공 상태에서 충분히 안정하고, 지질 탈착 고감도를 입증하고 양성 및 음성 이온 모드 모두에서 지질의 분석에 이용 될 수있다. 이러한 히드 록시 벤조산 (DHB) -9- aminoacridine (9-AA) 및 5- 클로로 -2- 머 캅토 벤조 티아 졸 (CMBT) 다른 네거티브 지질 친 화성 매트릭스에 비해 DAN 매트릭스는 가장 효율적으로 쥐 뇌에서 강글리오사이드를 탈착 할 수 있었다 음이온 모드 (준비 원고)의 조직.

매트릭스 증착의 적절한 방법을 선택하면 행렬 자체를 선택하는 동일한 중요하다. 액체 추가를 허용하는 샘플 침투를 고체 매트릭스는 유기 용매에 용해시키고, 공압에 의해 증착 또는 분무기 또는 감시인 자동화 항 젖은 매트릭스 증착 방법은 단백질 및 펩티드의 탈착에 특히 효과적매트릭스와 화합물 및 공동 결정의 ction. 이러한 기술은 또한 지질 애플리케이션 분석 비편 재화 얼룩 매트릭스 액정 형성을 위해 사용될 수 있지만, 특히 조직이,도 9에 의한 지질 용매에의 높은 용해성 풍부 공통 사건이된다. 지질 용이 조직에서 이온화되므로 이러한 기술의 단점의 대부분을 회피하면서, 예컨대 승화 건조 매트릭스 증착 기술은 분무기에 간단하고 비용 효율적인 대안을 제공한다. MALDI IMS 실험에서 승화의 성공은 습식 매트릭스 기술 1, 10에 비해 증가 재현성 선도 같은 결합 매트릭스 분석 물질에 대한 면적을 증가 미세 매트릭스 형태 증가 매트릭스 순도 및 균일 한 매트릭스 증착 등의 기능에 기인한다.

승화 invo바로 조직 샘플의 표면 상에 증착 한 다음 분쇄 된 매트릭스 기체 상 전이 고체 결과 냉각 된 샘플의 표면 아래에 진공 분말 행렬 가열 아이브. 승화 동안 매트릭스 증착 시간, 온도 및 재현성이 높은 결과를 제공하는 압력과 같은 다양한 요인들에 의해 제어 될 수있다. 하나의 승화 실험은 폐기하기 전에 여러 번 재사용 될 수있는 선택된 기질의 종류에 따라 5 내지 20 분에 걸릴 수있다. 이 장치는 자동 분무기의 가격의 일부에서 상업적으로 구입하실 수 있습니다 쉽게 청소 및 유지 보수를 위해 따로 촬영됩니다. 낮은 비용과이 행렬 증착 기술의 상대적 단순 시작 또는 MALDI IMS 지질 이미징 애플리케이션에 확장 연구자에 이상적이다. IMS에 대한 조직의 승화 프로토콜 디테일 정보 (11)에보고되었지만, 몇몇 표준 프로토콜 w 존재HICH 어려운 광범위한 시행 착오없이 기술을 확립 할 수있게, 음이온 모드에서 높은 질량 지질을 이미징 승화 실험을 수행과 관련된 기본적인 흐름에 초점을 맞춘다. 다음은 고해상도 이미지 및 갱글 검출하는 쥐 뇌 부 상 DAN 행렬의 승화 그 격차를 목표 실험 프로토콜이다.

그림 2
그림 2 : 승화 장치. 사진 (A) 및 승화 장치의 개략도 (B). 진공 펌프를 에탄올 300 mL로 채워진 냉각 트랩에 고무관으로 연결된다. 콜드 트랩은 다음 승화 장치 고무관으로 연결된다. 장치는 금속 U 조인트와 함께 밀봉 유리의 두 개의 분리 된 조각들로 구성된다. 승화의 위쪽 절반얼음 비자금으로 가득 콘덴서가 포함되어 있습니다. 샘플 플레이트는 유리 밀봉 장치 내부에, 콘덴서의 하부에 녹화된다. 승화 장치의 하단은 균일하게 샘플 플레이트에 직면 퍼져 DAN 행렬을 포함하고 있습니다. 승화하는 동안, 유리 장치 바로 아래에, 핫 플레이트에 의해 140 ℃로 가열 한 모래 욕에 배치된다. 온도 프로브 실험에 대한 설정 온도와 비교하여 모래 욕 온도 피드백을 통해 승화 실험을하는 동안 안정된 온도를 유지하는 데 도움. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

모든 동물의 처리 절차는 웨스턴 온타리오의 동물 관리위원회 (2016-014) 대학을 준수 설명. 1. 조직 준비 및 단면 "신선한 냉동 추출"(FFE)로 알려진 과정을 통해 쥐에서 뇌 조직의 압축을 풉니 다. 펜토 바르 비탈 나트륨의 과다 복용과 함께 쥐를 안락사와 사지의 반사 신경을 모니터링 할 수 있습니다. 모든 반사 신경이 중단되면, 단두대를 사용하여 쥐의 ?…

Representative Results

승화 실험 종료 후, 유리에있어서의 두 개의 반쪽들은 응축기를 녹화, 흄 후드와 슬라이드에서 분리된다 (도 3a)를 제거 할 수있다. 이 시점에서, 슬라이드, 다음 슬라이드 조정되어야 할 수도 모래 욕에있어서의 불균일 한 매트릭스 분포, 시간, 온도, 또는 위치를 조사한다. 성공적인 DAN 승화 실험 조직의 해부학 적 특징이 명확하게 가시화 될 수있는 슬라이드 …

Discussion

이 작품은 MALDI IMS 실험에서 같은 강글리오사이드와 같은 음으로 하전 된 지질의 검출을위한 조직에 매트릭스 승화의 표준화 된 프로토콜을 자세히 설명합니다. MALDI IMS에 대한 샘플 준비는 매우 다양하고 관심있는 분석의 고유 한 특성에 맞게 사용자 정의 할 수 있어야합니다. 조직 샘플의 표면 상에 매트릭스의 적용은 IMS에서의 검색 결과의 품질에 관해서 시료 준비 과정의 중요한 측면이다. 매?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Université de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Materials

Sublimator Chemglass Life Sciences CG3038-01
1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix Sigma-Aldrich D21200  100 G
Cryostat Thermo-Fisher Scientific CryoStar NX50
Hot plate with temperature feedback Thermo-Fisher Scientific HP88857290 Isotemp ADVD 7×7 HP 100-120v
Stainless Steel Jack Thermo-Fisher Scientific 2216479 10×10
Cold Trap Custom built on site
Vacuum Pump Franklin Electric 1102180403 Savant VP100 Two Stage
Indium-tin-oxide (ITO) Slides Hudson Surface Technology PSI 1111000 type II, 1.1mm/25 each
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument AB Sciex
Desiccator Sigma-Aldrich D2797 tabletop desiccator

Referencias

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Caughlin, S., Park, D. H., Yeung, K. K., Cechetto, D. F., Whitehead, S. N. Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (121), e55254, doi:10.3791/55254 (2017).

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