الإنتاج السريع في الفطريات عن طريق<em> الأجرعية</em> التحول بوساطة أوسكار حذف يبني
Summary
الجينات الحذف المسوخ ولدت من خلال إعادة التركيب مثلي هي المعيار الذهبي للدراسات وظيفة الجينات. يوصف أوسكار (خطوة واحدة بناء أغروباكتريوم-ريكومبيناتيون-ريسبونز-بلاسميدس) طريقة لتوليد السريع من يبني الحذف. الجراثيم بوساطة التحول الفطري يلي. وأخيرا، يتم عرض طريقة تأكيد ير القائم على الحذف الجينات في المحولات الفطرية.
Abstract
الحذف الدقيق للجينات (ق) من الفائدة، في حين ترك بقية الجينوم دون تغيير، ويوفر المنتج المثالي لتحديد أن وظيفة الجينات معينة في الكائن الحي. في هذا البروتوكول وصفت طريقة أوسكار من البناء البلازميد الحذف الدقيق والسريع. ويعتمد أوسكار على نظام الاستنساخ الذي يتم فيه رد فعل ريكومبيناس واحد يحتوي على تنقية ير تضخيم 5 'و 3' الأجنحة من الجين من الفائدة واثنين من البلازميدات، با-هيغ أوسكار (ناقلات علامة) و بوسكار (الجمعية قوه موجهة). يتم تأكيد ناقلات الحذف تجميعها بشكل صحيح من قبل رسم الخرائط الهضم تقييد تليها التسلسل. ثم يتم استخدام الجراثيم المبيضات للتوسط إدخال بناء الحذف في الجراثيم الفطرية (المشار إليها باسم أتمت). أخيرا، يوصف مقايسة ير لتحديد ما إذا كان بناء الحذف متكاملة من قبل إعادة التركيب مثلي أو غير متماثل، مما يدل على حذف الجينات أوالتكامل خارج الرحم، على التوالي. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لحذف العديد من الجينات في فيرتيسيليوم دالياي وفي فوزاريوم فيرتيسيليوادس بين الأنواع الأخرى.
Introduction
التشريح الجيني هو منهجية قوية لتحديد الأهمية الوظيفية للفرد أو مجموعات من الجينات. النهج القياسي لفهم دور جينات محددة هو إنتاج مسوخ الجينات واحدة دون تغيير في أي جين آخر. وأقوى وأقل احتمالا مربكة النهج الكامل والدقيق حذف الجين من إطار القراءة مفتوحة الفائدة (غوي أورف) دون ضرر لأي وظيفة الجينات الأخرى.
لأن نهج ربط القياسية لحذف جيل البلازميد تتطلب خطوات متعددة، وكان العقلاني ل أوسكار 1 لإنتاج أسرع في النهج المختبر . الشكل 1 يصور عملية التجميع في نهج أوسكار. الطريقة الموصوفة هنا لديها ميزة الجمع بين البناء السريع للنواقل الحذف الجينات الفردية في رد فعل متعدد الأجزاء واحد في تركيبة مع اللاحقة أغروباكتريوم توميفاسينس بوساطة ترانسفورماتيون (أتمت). أوسكار سريع جدا ويقارن جيدا مع استراتيجيات أخرى مثل استخدام الجمعية جيبسون في الخميرة 2 . وقد استخدمت طريقة أوسكار بنجاح مع العديد من أنواع أسكوميكوتا من الفطريات. وتشمل هذه الأنواع: فوزريوم فيرتيسيليوادس (غير منشورة)، فيرتيسيليوم دالياي 3 ، سيتوسفيريا تورسيكا 4 ، ميتارهيزيوم روبرتسي 5 ، فوزاريوم أوكسيسبورم f. س. 6 ، بيستالوفيوسيس ميكروسبورا 7 ، كوليتوتريتشوم هيجينزيانوم 8 ، و دوثيستروما سيبوسبورم 9 و ساروكلاديوم زي (غير منشورة) .
ويوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة تعليمات للطريقة بما في ذلك تصميم التمهيدي، الجناح ير التضخيم، رد فعل أوسكار بب، حذف بناء هيكل تأكيد، ترانزفورماتأيون من أغروباكتريوم مع بناء تليها أتمت نقل استنادا بناء الحذف في الخلايا الفطرية، وأخيرا التفريق المسوخ الحذف الفطرية من تلك التي يبني الحذف إكتوبيكالي المتكاملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم بناء خطوة واحدة بناء الجراثيم -Recombination جاهزة البلازميدات (أوسكار) بنجاح مع عدد متزايد من الفطريات أسكوميكوتا. وينبغي أيضا أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق بسهولة على باسيديوميكوتا والأنواع من فيلا الفطرية الأخرى (مع المروجين المناسب يقود الجينات علامة للاختيار…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون طلاب المرحلة الجامعية والثانوية التالية لعملهم لتوليد المسوخ أوسكار في فوساريوم فيرتيسيليويوديس : أنجليكا ميلر، اطهر نصير، شيوى لين، كاتلين وودبوري، تشيلسي باترسون، كاثلين روبرتسون، كريستينا برادلي، أشتون روجرز، أليكسيس ماكنزي، ماني هرنانديز ، أشلي كريبساك، جيف ديلونغ، كريستيان كينغ، جي جيونغ، ماريا بلدينج، كريستي بور، دانيال أوميرا، لورين (فيكتوريا) كوك، جيك غودمان، سامبريتي دي، أوج أوكوي، أليسا بيكستيد، غاريت هيبس، نيك غولدستين، كارولين توم ، كريس بينسون، لويس ستوكس، هانا إيتل، جين هولز، جاسم محمد، جيمس لوجينز، كيلي راسل، غريشنا جونز، كريستين شيفر، مريم حمادي، آفا ويلسون، كاترينا بازيمور، توني هاربر، كارلين ماكغي، محمد مومين، ريما مومين ، ثي نغوك لي وأنجل فام.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referencias
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
