Producción de eliminación rápida en hongos vía<em> Agrobacterium</em> Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs
Summary
Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.
Abstract
La deleción precisa de los genes de interés, dejando el resto del genoma sin cambios, proporciona el producto ideal para determinar la función de ese gen particular en el organismo vivo. En este protocolo se describe el método OSCAR de construcción de plásmidos de deleción precisa y rápida. OSCAR se basa en el sistema de clonación en el que se lleva a cabo una única reacción de recombinasa que contiene los flancos 5 'y 3' amplificados por PCR purificados del gen de interés y dos plásmidos, pA-Hyg OSCAR (el vector marcador) y pOSCAR vector). La confirmación del vector de deleción correctamente ensamblado se lleva a cabo por mapeo de digestión de restricción seguido por secuenciación. Agrobacterium tumefaciens se utiliza entonces para mediar la introducción de la construcción de deleción en esporas de hongos (denominado ATMT). Por último, se describe un ensayo de PCR para determinar si la construcción de deleción se integra mediante recombinación homóloga o no homóloga, indicando deleción de gen oEctópica, respectivamente. Este enfoque se ha utilizado con éxito para la deleción de numerosos genes en Verticillium dahliae y en Fusarium verticillioides entre otras especies.
Introduction
La disección genética es una poderosa metodología para determinar la importancia funcional de individuos o combinaciones de genes. Un enfoque estándar para comprender el papel de genes específicos es la producción de mutantes de un solo gen inalterados en cualquier otro gen. El enfoque más potente y menos potencialmente confuso es la supresión completa y precisa del marco de lectura abierto de un gen de interés (GOI ORF) sin dañar ninguna otra función génica.
Debido a que los enfoques de ligación estándar para la generación de plásmidos de deleción requieren múltiples etapas, el racional para OSCAR 1 era producir un enfoque in vitro más rápido. La figura 1 representa el proceso de montaje en el enfoque de OSCAR. El método descrito aquí tiene la ventaja de combinar la construcción rápida de vectores individuales de deleción de genes en una única reacción de múltiples partes en combinación con el posterior transfo mediado por Agrobacterium tumefaciensRencia (ATMT). OSCAR es muy rápido y se compara bien con otras estrategias como el uso del ensamblaje Gibson en levadura 2 . El método OSCAR se ha utilizado con éxito con varias especies de hongos Ascomycota. Estas especies incluyen: Fusarium verticillioides (inédito), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 y Dothistroma septosporum 9 y Sarocladium zeae (inédito) .
Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el método que incluye diseño de cebador, amplificación por PCR de flanco, reacción de OSCAR BP, confirmación de estructura de construcción de deleción, transformaciónDe Agrobacterium con el constructo seguido de la transferencia basada en ATMT de la construcción de deleción en las células fúngicas y finalmente diferenciando mutantes de deleción de hongos de aquellos con construcciones de deleción ectopicamente integradas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La construcción en un solo paso de los plásmidos preparados con recombinación de Agrobacterium (OSCAR) se ha empleado con éxito con un número cada vez mayor de hongos Ascomycota. El método también debe ser fácilmente aplicable a Basidiomycota y especies de otros phylas de hongos (con promotores apropiados que conducen genes marcadores seleccionables), suponiendo que la transformación mediada por Agrobacterium y la recombinación homóloga son posibles. Se han generado vectore…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los siguientes estudiantes de pregrado y secundaria su trabajo para generar mutantes OSCAR en Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie y Manny Hernández Ashly Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, María Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le y Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referencias
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