Мы представляем высокое содержание анализа (HCA) инструмент с открытым исходным кодом с использованием автоматизированного пожизненную флуоресцентной томографии (FLIM) для опробования белковых взаимодействий с использованием Forster резонансного переноса энергии (FRET) отсчеты основе. Сбор данных для этого openFLIM-HCA инструмента контролируется программное обеспечение , написанное в μManager и анализ данных осуществляется в FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Все более широкое использование автоматизированного высокого контент – анализа (ГКА) в обнаружении наркотиков 1 к библиотекам соединений анализа дополняется тенденцией в области наук о жизни фундаментальных исследований в направлении автоматизированных экспериментов визуализации для систематических исследований, например, для фенотипических экранов библиотек миРНК. Автоматизированная HCA также становится все более важным для небольших масштабных биологических исследований, которые, как правило, были реализованы с помощью ручных экспериментов с десятками блюд клеток визуализируют с помощью обычных микроскопов. Статистическая мощность предоставляемое способности для анализа и анализировать сотни тысяч полей зрения позволяет усреднение экспериментального шума (в том числе «биологического шума») и автоматизации сбора и анализа больших выборочных массивов данных изображения может помочь устранить смещения оператора и часто может быть использован для обнаружения возникновения систематических ошибок, таких как изменения в профиле IRF во время сбора данных. Анализы на основе флуоресценциишироко применяются в ГКА, с наиболее коммерчески доступными ГЛК Instrumentation отличая томографию интенсивности флуоресценции в одном или нескольких спектральных каналов для отображения относительного распределения и совместной локализации меченых белков. Более сложные методы флуоресцентной визуализации, такие как время жизни флюоресценции томографии (FLIM), анизотропия поляризации изображения и визуализации анизотропии флуоресценции с временным разрешением, не очень широко использовались в коммерческих инструментов HCA, хотя они предлагают мощные количественные отсчеты, например, белковых взаимодействий. Здесь мы представляем подход источник открытой для реализации FLIM в автоматизированном микроскопа для ГКА.
время жизни флюоресценции обеспечивает по своей сути логометрические спектроскопического считывания, которые могут быть использованы для выделения различных видов молекул или исследовать местную молекулярную среду флуорофором и нечувствителен к концентрации флуорофора, к повышению эффективности возбуждения / обнаружения, а также к воздействию scatteкольцо и образец поглощения 2. Кроме того, поскольку измерения времени жизни флуоресценции могут быть выполнены в одном спектральном канале, они сопоставимы между различными инструментами и образцами без калибровки. Они могут быть применены к действию эндогенных флуорофоров, в том числе некоторых клеточных метаболитов, липидов и компонентов внеклеточного матрикса, чтобы обеспечить внутренние отсчеты биологических процессов и патологий. Таким образом , метка свободной FLIM может отображать метаболические изменения в клетках 3,4 и применяется для контроля стволовых клеток дифференцировки 5,6 и рост коллагеновых лесов 7. Недавно мы показали , что FLIM ГЛК может быть использован для автоматизированных без наклеек анализов клеточного метаболизма с использованием аутофлуоресценцию 8. Чаще всего, однако, измерения времени жизни флуоресценции и FLIM применяются к экзогенных флуорофоров, которые маркируют определенные биомолекулы, часто реализуется с использованием красителей, которые Stain клеточных отсеков, с помощью красителей в сочетании с antibodies, которые ориентированы на конкретные белки в фиксированных клетках, или с использованием генетически выраженных флуорофоров в сочетании со специфическими белками. время жизни флюоресценции, могут быть использованы для обеспечения надежных количественных отсчеты флуоресцентных зондов считывающих их физической или химической среды. Для примеров, красители были развернуты , чтобы почувствовать местный липидной фазы клеточных мембран 9 или вязкости элементов 10 и генетически выраженными флуоресцентного белка на основе биосенсоров были разработаны , чтобы сообщать о концентрации клетки сигнальных молекул в том числе , как IP3 11, PIP2 12 и кальпаином 13 или ионы , такие как кальций, калий 14,15 16 и хлорид 17.
Многие такие биосенсоры используют Ферстер – резонансная передача энергии (FRET) 18,19 , чтобы обеспечить отсчеты изменений в биосенсора конформации. FRET между «донором» и «акцепторных» флуорофоров происходит посредством прямого диполь-дипольного взаимодействия малого радиуса действиядля которых флуорофоры, как правило, разделены менее чем ~ 10 нм. Таким образом, обнаружение FRET указывает на тесную близость надлежащим образом меченых белков и , следовательно , обеспечивает средство для считывания белок-белковых взаимодействий 20, такие как связывание или олигомеризации – либо в качестве конечных точек в фиксированных клетках или в качестве динамических событий при измерениях курса временных живой клетки. Навешивая соответствующую молекулярную конструкцию как с донором и акцептором флуорофоров, также можно считывать конформационные изменения – или расщепление – конструкта посредством изменения FRET , и это является основой многих биосенсоров 21. Измерения эффективности FRET может предоставить информацию о расстоянии донорно-акцепторной и доли населения доноров флуорофоров, подвергающихся ладу. Таким образом, методы визуализации FRET основе может быть использован для отображения и количественного определения молекулярных взаимодействий в пространстве и во времени, например, для выяснения клеточной сигнализации процессов 22. AutomatИНГ такие методы визуализации могут обеспечить высокую пропускную способность анализов на основе считываниями сигнальных путей или сетей.
В ГКА, лада считывания чаще всего осуществляется спектрально ратиометрический изображений, где изменения в соотношении акцептора к интенсивности донора отображаются. Хотя такой подход легко реализован – и доступен во многих коммерчески доступных читателей многоямный плит – количественные спектрально разрешенных измерений FRET требует калибровки спектрального отклика системы 23. Это включает в себя спектральную перекрестные помехи, возникающие из спектрального проступание и прямого возбуждения акцептора, а также характеристик передачи инструмента и образца (внутренний эффект фильтра). В принципе, это влечет за собой измерение дополнительных "контрольных" образцов, которые обозначены как донор или только акцептор-только.
Из таких спектральных измерений логометрических FRET, эффективная FRETЭффективность (продукт фактической эффективности FRET и доли FRETing молекул донора / акцептор) могут быть получены вместе с относительной доли молекул донора и акцептора 24. Спектральный ратиометрический FRET часто используется с мономолекулярному FRET биосенсоров, где донор / акцептор стехиометрии можно считать известными. Для определения доли населения донора FRETing и акцептора, например, чтобы получить кривую зависимости ответа от дозы, знание фактической эффективности FRET требуется. Это может быть получено путем измерения положительного контрольного образца ладу известными свойствами или с помощью другого метода для измерения эффективности FRET, такие как акцепторного фотообесцвечивания или FLIM.
Использование жизни флуоресценции отсчеты, FRET могут быть обнаружены и количественно с помощью измерений только излучения донора – устраняет необходимость спектральной калибровки и последующих контрольных образцов. Таким образом, FLIM FRET показания можно сравнить между инструментамиа также между различными образцами – позволяет данным эндоскопии или томографии моделей живых болезней 25 будут сопоставляться с измерениями клеточных анализов. Соответствуя профили затухания флуоресценции донора к соответствующей модели мульти-экспоненциального затухания, соответствующей FRETing и не являющихся FRETing популяций доноров, FRET эффективность и фракции населения могут, в принципе, можно получить непосредственно без дальнейших измерений. Эти значительные преимущества, однако, приходят за счет FLIM требующих более детектируемых фотонов на пиксель, чем спектральным разрешением изображения интенсивности – как правило, сотни фотонов, необходимых для достижения точности в определении продолжительности жизни на 10%, когда прилегают к одной модели экспоненциального распада и когда подгонка профилей затухания флюоресценции до сложных моделей (multiexponential распад), число обнаруженных фотонов требуется увеличивается до тысячи. Это обычно приводит к длительным временем приобретения (от десятков до сотен секунд на поле VIЭВ) для FLIM, особенно при использовании времени коррелировали счета одиночных фотонов (TCSPC), реализованный с последовательным приобретением пикселей в лазерных сканирующих микроскопов. Попытки увеличить скорость обработки изображений с использованием более высоких интенсивностях возбуждения может приводить к значительному фотообесцвечиванию и / или фототоксичности. Вместе с отсутствием соответствующих коммерчески доступных приборов и программных средств, это мешало FLIM от быть использованы в ГКА для обнаружения или систем наркотиков биологии, где сотни до нескольких тысяч полей зрения должны быть отображены. Лазерное сканирование TCSPC FLIM реализован в автоматизированной многоямного пластины микроскопа 26 для вторичных измерений После идентификации "хитов" по стационарной поляризации с разрешением анизотропии флуоресценции изображения 27, которая может достигать подобных скоростей визуализации для спектрального логометрической изображения 28 , с которым она разделяет много преимуществ и недостатков. Флуоресцентная анизотропия изображения использует уменьшениев анизотропии флуоресценции акцептора в присутствии FRET и также чувствителен к спектральному перекрестных помех (например, прямое возбуждение акцептора). Она требует калибровки для учета поляризации перекрестных помех и не обеспечивает прямое измерение эффективности FRET.
Для того, чтобы реализовать преимущества FLIM для ГКА, мы работали, чтобы решить вопросы скорости получения изображения и более широкого доступа к этой технологии. Здесь мы предоставляем полный перечень открытых источников программного обеспечения и аппаратных компонентов, которые могут быть использованы для реализации автоматизированного быстрого FLIM Multiwell планшет-ридер, который описан ниже, вместе с образцом FRET на основе-анализов. В нашем подходе 29, FLIM реализуется с использованием временной селекцией изображений широкого поля с использованием закрытого типа оптического усилителя яркости изображения (ГОИ), который показан на рисунке 1 , который может обеспечить более высокую скорость обработки изображений и более низкую фотообесцвечивание чем однолучевом сканирования TCSPC в связи с параллельный пиксель INTERRogation. Наш openFLIM-HCA инструмент может обеспечить неконтролируемый FLIM, требуя всего несколько секунд , чтобы получить данные FLIM обнаружения несколько 100 фотонов на пиксель ( в зависимости от яркости образца). В сочетании с временем , необходимым для перемещения образца из предыдущего поля зрения, чтобы настроить параметры сбора и поддержания образца в фокусе, это обычно приводит к луночные времени приобретения пластины ~ 10 с на поле зрения 25,28. Оптический секционирования может быть реализован с использованием квази-широким полем Нипкова ( "вращающийся диск") сканера 30.
Для FLIM анализа данных, мы разработали инструмент с открытым исходным кодом под названием FLIMfit 31 , который способен быстро анализировать Multiwell наборов данных пластины FLIM на обычных рабочих станций ПК и представляет собой подключаемый модуль для Omero 32. FLIMfit предоставляет глобальные возможности анализа (обсуждается в разделе 1.2) , которые позволяют FLIM данные для установки на сложных моделей с уплотнительнымNLY несколько 100 фотонов на пиксель в предположении, что компоненты времени жизни флуоресценции инвариантны поперек изображения или области интереса (ROI), тем самым уменьшая количество зарегистрированных фотонов требуется, освещенность на образец и получения изображений времени. Запуск FLIMfit на стандартном настольном ПК, требуется только 10s секунд вычислительного времени для анализа наборов данных , содержащих сотни ПЗ. Таким образом, оба FLIM сбора и анализа данных может осуществляться на временных масштабах, которые являются практичными для ГКА.
openFLIM-HCA аппаратное обеспечение
Наша реализация FLIM HCA состоит из шести основных компонентов: (I) флуоресцентного микроскопа кадр с оптическим автофокусом; (II) моторизованной (хуг) столик микроскопа; (III) источник лазерного возбуждения; (IV) во времени закрытого типа система FLIM широкого поля с закрытого типа оптического усилителя (ГОИ), генератора задержки и камеры; (V) компьютер для сбора и анализа данных и (VI) сканера Нипкова дискаблок для оптически секционного визуализации для подавления вне фокуса света. Это может быть важно при визуализации слабых сигналов, например, от FRET биосенсоров на клеточной мембране плазмы, которая может быть перегружен за счет взносов цитоплазматической флуоресценции или фона от покровных или культуральной среды. Время закрытого данных FLIM приобретается путем освещения образца с ультракороткого импульсного излучения возбуждения, визуализации флуоресцентное излучение на фотокатод ГОИ и приобретая серию ПЗС-изображений люминофора ГОИ для диапазона настройки времени задержки оптический усилитель ворота после прихода импульсов возбуждения. По мере увеличения времени задержки затвора при возбуждении, сигнал флуоресценции наблюдается уменьшение и разные моменты времени селекцией интенсивности изображений флуоресценции, полученных на ПЗС-матрицы формируют набор данных, необходимых для анализа профилей распада всех флуорофоров в поле зрения , Стробирование ГОИ синхронизирован с импульсами возбужденияи, для серии ПЗС-приобретениям, задержка времени затвора относительно импульса возбуждения устанавливается на ряд возрастающих значений в течение требуемого диапазона. Эта синхронизация достигается с использованием генератора задержки, которая содержит «быструю коробку задержки" (при условии задержки до 20 нс с шагом 1 пс) и "грубая ящик задержки", которая обеспечивает задержку с минимальным шагом 25 пс.
Для FLIM, возбуждение может быть обеспечена с помощью любой сверхбыстрого лазера. Для удобства мы обычно используют волоконно-лазерной накачкой источник суперконтинуум, который обеспечивает пикосекундных импульсов, перестраиваемого по всей видимой части спектра, из которого соответствующее возбуждающее излучение может быть выбран для любого флуорофора с помощью моторизованного фильтра колесо с различными полосовых фильтров. Как правило, мы используем среднюю мощность ~ 100-200 мкВт на образце с импульсами с частотой повторения 40 или 60 МГц. Такие полномочия возбуждения также может быть обеспечено сверхбыстрых лазерных источников на основе удвоения частотыс синхронизацией мод титана, легированного сапфировые лазеры. Следует отметить, что длительность импульса возбуждения ниже ~ 100 пс достаточно для большинства экспериментов. Второй моторизованный фильтр колеса оснащены фильтрами нейтральной плотности используется для регулирования интенсивности возбуждения. Для удобства и безопасности, возбуждающее излучение может быть доставлены с помощью одномодового оптического волокна. Конфигурации для широкого поля FLIM и оптически секционного FLIM представлены на рисунках 2 и 3 соответственно. Для получения более подробной информации о точных компонентов , используемых, пожалуйста , посетите openFLIM-HCA вики 33. Копия текущего списка деталей приведен в дополнительных материалах.
Для широкого поля FLIM, излучение возбуждения требуется, чтобы осветить все поле зрения как можно более равномерно. Для этого направляйте лазерный луч возбуждения к голографическим "прямоугольным" диффузор, который вращается при 10-50 Гц до среднего времени лазерный спекл, с плоскостью дифТермоблок изображаемого в задней фокальной плоскости объектива микроскопа объектива. Флуоресцентного изображения с выходного порта микроскопа передается на фотокатод ГОИ и люминофора ГОИ (активная зона по диагонали 18 мм) проецируется на датчик охлаждаемого научной CCD (размер чипа 10,2 мм х 8,3 мм) камерой с помощью пары объективов, обеспечивающих увеличение в размере 0,7. Система управляется с помощью стандартного ПК, сопряженного с измерительных приборов с использованием протоколов RS232. Кроме того, Ардуино микропроцессор используется для управления затвором на пути света возбуждения, который закрыт, за исключением, когда камера CCD приобретает FLIM данных и для записи сигнала с фотодиода, который используется для измерения средней мощности от спектрально отфильтрованный сверхуширенного источник возбуждения. Для оптически секционного FLIM, лазерное излучение возбуждения соединяется в одномодовое с сохранением поляризации оптического волокна, который подключается непосредственно к блоку сканера Нипкова диска, а сhown на рисунке 3. Выход флуоресцентного изображения из блока сканера Нипкова передается на фотокатод ГОИ и остальная часть системы такая же, как для широкого поля FLIM.
Программное обеспечение openFLIM-HCA
Программное обеспечение сбора данных записывается в μManager 34. Она обеспечивает полную HCA данных функциональные возможности приобретения, включая варианты, чтобы изменить последовательность, в которой изображаются лунки пластины, чтобы получить время курсы для любого FOV, чтобы автоматически сохранять фокусировку во время измерений и контроля возбуждения и фильтрации выбросов колеса и дихроичным чейнджером для автоматизированной обработки изображений многоцветной. Кроме того , можно запустить "предварительного сканирования" приобретение интенсивности флуоресценции для того , чтобы автоматически выявлять и фиксировать позиции подходящих для ПЗ последующего FLIM приобретения в соответствии с критериями, например, на основе интенсивности. FLIM данные HCA могут быть сохранены в виде рядаиз TIFF файлов, в виде серии Оме-TIFF файлов (то есть, один за FOV) или в виде одного файла Оме-TIFF включающая в себя все данные из многоямного пластины. Более подробную информацию и подробное описание программного обеспечения μManager можно найти на openFLIM-HCA вики 33.
Программное обеспечение для анализа данных, FLIMfit 31, клиент с открытым исходным кодом на основе MATLAB для платформы 32 управления данными Omero изображений, умеет читать FLIM данные с сервера Omero или с диска компьютера, как показано на рисунке 4. Она была разработана для анализа данных из TCSPC или времени закрытого типа FLIM приборов шириной поля и предоставляет много возможностей, чтобы соответствовать данным из openFLIM-HCA включая прилегают к моноэкспоненциален профили распада, а также двойное экспоненциальное и более высокие профили распада сложности, включая такие модели, как поляризационные разрешением профили затухания флуоресценции. Он может также принять во внимание фиксированных и изменяющихся во времени фоновых сигналов и может ИМПатрических измеряется пространственно-временной функции отклика прибора (МАФ) или может поместиться используя идеализированный МАФ, которые могут быть сдвинуты во времени на пиксель-накрест основе на величину, определяемую из полного экспериментального измерения IRF. Глобальная разница во времени (T 0) между МАФ и флуоресцентной пробе может быть определено исходя из результатов измерения стандарта флуоресценции. Пространственные вариации фоновых сигналов и МАФ также могут быть приняты во внимание. FLIMfit способен соответствовать FLIM данные на пиксельной-накрест основе или с помощью "глобального биннинга" или "глобальной" фитинг для облегчения подгонки данных FLIM со скромными (сотни) фотонов числа сложных моделей распада.
Глобальный бининг влечет за собой агрегирование всех обнаруженных фотонов из пикселей в пределах определенного пользователем ROI в каждый момент времени , чтобы обеспечить достаточное количество фотонов для облегчения подгонки к сложным моделям распада. ROI может быть все поле зрения (FOV), это может быть вручную defined пользователем, или оно может быть определено с помощью сегментации изображений инструментов. ROI также можно определить с помощью масок , импортированные в FLIMfit от другого программного обеспечения сегментации изображений. Для приложений FRET, он является общим для использования глобальной биннинга в соответствии с моделью двойного экспоненциального распада определить компоненты времени жизни флуоресценции, соответствующие FRETing и не-FRETing флуорофоров доноров, которые предполагаются пространственно инвариантны по ROI, а затем переоборудовать на пиксель-накрест основа с этим срок службы компонентов долинами фиксированными для того, чтобы получить фракцию среди доноров FRETing в каждом пикселе.
Глобальная фитинга влечет за собой одновременно насадке элементов жизни , и пиксельные-накрест фракции доноров FRETing населения через весь FOV- или через FLIM набор данных , которые могут содержать множество ПЗ, например, из многоямного эксперимента пластины или временной последовательности жизни флуоресценции изображений. Глобальный фитинга может использовать пространственную variatiна фракций населения по всему изображению , что теряется в глобальном биннинга подходе , чтобы обеспечить более сильные ограничения на оценке компонентов продолжительности жизни – и , следовательно , более надежные результаты – хотя и по стоимости значительно больше вычислений 35. FLIMfit может быстро анализировать Multiwell пластины FLIM наборы данных с глобальными штуцером на обычных рабочих станциях ПК, например, многоямного времени закрытого типа набор FLIM данные, приобретенные с пятью время воротами для каждого из 394 FOV каждая из которых содержит 672 х 512 пикселей, что требует только 32 секунд и 2 Гб оперативной памяти , чтобы соответствовать к двойной модели экспоненциального затухания 31. Это было достигнуто за счет использования сепарабельный нелинейной наименьших квадратов алгоритм , реализованный с использованием многопоточных параллельных алгоритмов для обеспечения эффективного масштабирования на многоядерных процессорах и код FLIMfit был оптимизирован для минимизации использования памяти. На рисунке 5 показан снимок графического пользовательского интерфейса FLIMfitи более подробную информацию можно найти на веб-странице, приведенной в справочнике 36. Дополнительная информация о глобальном фитинга и глобальной биннинга можно найти в ссылке 31.
Следующий протокол для FLIM HCA с помощью нашего openFLIM-HCA приборов и программного обеспечения могут быть адаптированы для широкого спектра экспериментов визуализации клеток с FLIM считываниями. В общем, многоямный пластины FRET эксперименты должны быть разработаны, чтобы включать в себя дублирующие лунки положительного и отрицательного биологического контроля в дополнение к условиям исследуемого. Здесь мы опишем конкретную реализацию для выполнения оптически секционного FLIM (смотри рисунок 3) клеток Cos , экспрессирующих FRET конструкций , состоящий из mTurquoise флуоресцентного белка и Венера флуоресцентного белка , соединенных коротким пептидным линкером. Здесь mTq32V, mTq17V и mTq5V FRET конструкции (обсуждается в разделе репрезентативные результаты) обеспечивают низкую, среднюю и высокую эффективность FRET вместе с не FRETing mTq5A построить.Эти конструкции и другие материалы, необходимые, чтобы следовать этому протоколу, перечислены в списке материалов.
Мы описали автоматизированную Multiwell пластину микроскопа, предназначенный для ГКА с использованием времени закрытого типа FLIM. Этот прибор управляется с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом , написанный на μManager с возможностью сохранения данных на сервер Omero и анализа данных FLIM реализуемую с помощью FLIMfit 36, с открытым исходным кодом программы , написанной на MatLab и доступный в качестве клиента Omero 32 μManager инструмент Управляющее программное обеспечение, openFLIM-HCA, доступен в Интернете 33 со списком компонентов системы 48 , чтобы дать возможность академических исследователей строить свои собственные FLIM HCA инструменты.
Для того чтобы получить надежные данные FLIM, необходимо оптимизировать настройки приобретения ГОИ и CCD и принимать во внимание любые вариации в т 0. Как описано в разделе 3.8.2, ГОИ установка усиления и CCD камеры времени интегрирования должна быть установлена, чтобы достичь ~ 75% от CCD динамического диапазона. Uпеть более высокое напряжение ГОИ и множественные накопления ПЗС кадра в каждом времени задержки затвора увеличивает соотношение сигнал – шум 49 , но это увеличивает общее время захвата FLIM (так как меньше фотонов флуоресценции, приобретенные за кадр перед насыщается CCD камеры и поэтому количество скоплениями кадров должны быть увеличены) и поэтому этот компромисс должен решаться для каждого эксперимента. Калибровка генератора задержки зависит от скорости лазерного повторения и, следовательно, необходимо, чтобы гарантировать, что правильный файл калибровки для частоты повторения, используемого загружается в программное обеспечение сбора данных. Процедура калибровки коробки задержки можно найти на openFLIM-HCA вики 33.
Если сотовый аутофлуоресценция мала по сравнению с сигналом флуоресценции, мы используем сигнал из хорошо, содержащей только питательную среду для обеспечения изменяющегося во времени фона (TVB). Для того, чтобы свести к минимуму фоновой флуоресценции из клеточной культуральной среды, мы избегаемносителей, содержащих фенол красный. Если сотовый аутофлуоресценция значительна, то TVB может быть получена из измерений немеченых клеток. Тем не менее, в этом случае необходимо позаботиться о том, как это предполагает, что фон аутофлуоресценция является одинаковым для каждого пиксела в изображении. Это предположение не будет действительным, если аутофлуоресценция значительно варьируется в зависимости от ячейки или, если луч возбуждения или чувствительность обнаружения не является равномерным по полю зрения.
Приобретение изображения IRF с использованием рассеянного света возбуждения импульсов обеспечивает временной профиль IRF, который свернут с моделью данных в процессе подбора, а также обеспечивает отображение пространственного изменения МАФ по полю зрения. МАФ может быть измерена с помощью построения изображения рассеивающего образца, такие как коллоидная суспензия, хотя, в нашем приборе, с использованием возбуждения рассеивание света с диска Нипкова обеспечивает более чистое измерение IRF. Точное определение сроков выводае МАФ имеет важное значение, так как ошибки в временной задержки между возбуждением и времени стробирования может существенно повлиять на процесс подбора, особенно при монтаже сложных моделей экспоненциального распада. МАФ, приобретенный с помощью рассеянного света возбуждения не точно, что необходимо для процесса подгонки, так как он был записан при длине волны возбуждения, а не на длине волны излучения флуоресценции, что может повлиять на ее сроки, несмотря на то пространственные вариации МАФ должны быть одинаковыми на обеих длинах волн. Кроме того, рассеянный МАФ может быть глобально сдвинуты во времени по отношению к истинному IRF из-за отличающимися длиной оптического пути от рассеивающего объекта, как это имеет место для IRF приобретенного с диска Нипкова в оптически секционного FLIM. Эта поправка, т 0, что требуемое глобальное временной сдвиг , который должен быть применен к приобретаемой рассеянного света возбуждения IRF, рассчитывается по данным моноэкспоненциален ссылка на красителях , как указано в Protocшаг ол 4.4. Следующие красители могут быть использованы для различных длин волн возбуждения: 75 мкМ Кумарин 153 раствор в метаноле (τ ~ 4,3 нс 50) может быть использовано для возбуждения в диапазоне 295-442 нм; 6 раствор 75 мкМ Кумарин в этаноле (т ~ 2,43 нс 37) может быть использовано для возбуждения в диапазоне 430-500 нм; и 75 мкМ родамина В раствор в воде (т ~ 1,7 нс 37) может быть использовано для возбуждения в диапазоне 488-575 нм. Заметим , что, хотя возможно в FLIMfit использовать различные IRF для каждого пикселя системы, как правило , имеет смысл сделать предположение о том , что пространственно различной МАФ имеет тот же временной профиль для каждого пикселя в изображении , но представляет ряд пространственно изменчивостью временных смещений относительно глобального T 0. Мы описываем это как карта сдвига IRF, которая определяется из рассеянного света МАФ. Вместе профиль МАФ, т 0 и отображение IRF сдвига используются для ваннойУбедитесь, что каждый пиксель в FOV оснащен соответствующим МАФ. Важно отметить, что т 0 может медленно меняться с течением времени , поэтому она должна быть измерена перед любым приобретением FLIM данных.
Пользователь должен решить, как образец профили затухания флюоресценции и требуется установить ширину временных ворот и их относительные задержки после возбуждения. В общем, желательно использовать большую ширину ворот, чтобы максимизировать обнаруженный сигнал и, как правило, мы используем воротных ширины установлено в 4 нс для FLIM клеток, меченных флуоресцентными белками. Число временных задержек затвором должно быть достаточным, чтобы образец флуоресцентного профиль распада (в том числе одни ворота набор для измерения сигнала непосредственно перед импульсом возбуждения) с учетом сложности подгонки модели, которая будет использоваться в анализе. Оптимальное значение может зависеть от времени жизни и относительных амплитуд составляющих распада. В общем, 4 ворот достаточно для подгонки моноэкспоненциален распадов в то время как 7 или более ворота могутбыть использованы для более сложных моделей распада.
Заметим , что FLIM могут быть реализованы с использованием целого ряда методов во временной области или частотной области и автоматизированных FLIM HCA из луночные массивов пластин впервые была реализована в (без секционирования) широкого поля микроскопа с использованием прижизненные частотной области отсчеты из FRET 51. Первый автоматизированный оптический секционирования FLIM считыватель многоямный пластина для ГКА с использованием широкого поля во времени закрытого типа изображений 28 затем сообщается. Впоследствии, широкого поля (не секционирования) частотной области FLIM HCA был применен для скрининга на пост трансляционных модификаций (фосфорилирование тирозина) через библиотеки генов с использованием FRET 52 и времени закрытого FLIM HCA был применен к FRET анализы на ВИЧ-1 Gag олигомеризации 53 и SUMOylation из FOXM1 54 и из Raichu RhoA и RAC1 биосенсоров 33. Кроме того , можно использовать для TCSPC многоямного пластины FLIM 26 , но на сегодняшний день это оказалось сложной задачей , чтобы соответствовать Tон пропускной способности методов обнаружения эксплуататорских широкого поля. Одной из новых подход , который мог бы решить эту проблему , является использование массивов одиночных детекторов подсчета фотонов , таких как SPAD массивы 55.
Заметим , что любые показания из FRET с использованием флуоресцентных белков следует относиться с осторожностью и что абсолютные значения параметров , полученных из FLIMfit или любого другого программного обеспечения для анализа FLIM будет зависеть от предположений , связанных с фитинга моделью. Например, когда донор FRET, имеет значительную второй компонент распада, использование биэкспоненциальному модели, чтобы соответствовать данным FRET FLIM может привести к вкладу быстрее распада компонента, как правило, связанной с населением FRETing появляться выше, чем должен. Поэтому желательно использовать доноров с монофонической экспоненциальный жизни, таких как mTq2FP. Даже тогда, недавние исследования показали, что анализ FRET все еще могут быть затронуты темные состояния акцептора флуоресцентных белков или путемНеоднородность коэффициента ориентации х 2 в связи с распределением флуорофора конформаций с различными углами хромофора и расстояния 56. Тем не менее, мы и другие показали, что время жизни флуоресценции от FRET показания действительно производят полезные результаты, которые коррелируют с биохимическими измерений и могут быть использованы для скрининга белковых взаимодействий или следовать динамике биосенсоров. Таким образом , эта openFLIM HCA платформа может быть применена к широкому кругу жизни флюоресценции на основе анализов с использованием FRET или клеточного аутофлюоресценция 8, а также предоставление количественных отсчеты на основе красителя зондов 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |