Nous présentons une open source haute analyse de contenu (HCA) en utilisant l'instrument automatisé d'imagerie de fluorescence à vie (FLIM) pour analyser les interactions entre protéines en utilisant Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) Affichages sur la base. L' acquisition de données pour cet instrument openFLIM-HCA est contrôlé par un logiciel écrit en μManager et l' analyse des données est effectuée en FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
L'utilisation croissante de l' analyse de contenu haute automatisé (HCA) dans la découverte de médicaments 1 à des banques de composés d'essai est complété par l'évolution de la science de la vie de la recherche fondamentale vers des expériences d'imagerie automatisées pour des études systématiques, par exemple, pour les écrans phénotypiques des bibliothèques siARN. HCA automatisé est également de plus en plus important pour les petites études à grande échelle biologique qui ont généralement été mises en œuvre avec des expériences manuelles avec des dizaines de boîtes de cellules imagées avec des microscopes conventionnels. La puissance statistique conférée par l'aptitude à doser et d'analyser des centaines à des milliers de champs de vision permet la moyenne du bruit expérimental (y compris le «bruit biologique») et l'automatisation de l'acquisition et l'analyse de grands réseaux d'échantillons de données d'image peut aider à éliminer le biais de l'opérateur et souvent peut être utilisé pour détecter l'apparition d'erreurs systématiques, par exemple un changement dans le profil de l'IRF lors d'une acquisition. Fluorescence base des essaissont largement mis en œuvre en HCA, avec la plupart des instruments disponibles dans le commerce HCA avec l'imagerie d'intensité de fluorescence dans un ou plusieurs canaux spectraux pour cartographier la distribution relative et la co-localisation des protéines marquées. Plus sophistiqués modalités d'imagerie de fluorescence, telles que l' imagerie de fluorescence à vie (FLIM), la polarisation anisotropie imagerie et anisotropie de fluorescence imagerie résolue en temps, ne sont pas largement exploitées dans les instruments de HCA commerciaux, bien qu'ils offrent des lectures quantitatives puissantes, par exemple, des interactions entre protéines. Nous présentons ici une approche open source pour la mise en œuvre FLIM dans un microscope automatisé pour HCA.
Vie de fluorescence fournit une lecture spectroscopique inhérente ratiométrique qui peut être utilisé pour distinguer les espèces moléculaires différentes ou pour sonder l'environnement moléculaire local d'un fluorophore et est insensible à la concentration en fluorophore, à l'efficacité d'excitation / détection et à l'impact de scatteanneau et échantillon absorption 2. En outre, étant donné que les mesures de fluorescence de durée de vie peuvent être réalisées dans un seul canal spectral, ils sont directement comparables entre les différents instruments et les échantillons sans étalonnage. Ils peuvent être appliqués à des fluorophores endogènes, y compris des métabolites cellulaires, des lipides et des composants de la matrice extracellulaire, pour fournir des lectures intrinsèques des processus biologiques et des pathologies. Ainsi FLIM sans étiquette peut cartographier les changements métaboliques dans les cellules 3,4 et a été appliqué pour surveiller la différenciation des cellules souches 5,6 et la croissance des échafauds de collagène 7. Nous avons récemment démontré que FLIM HCA peut être utilisé pour des tests automatisés sans étiquette du métabolisme cellulaire utilisant autofluorescence 8. Plus communément, cependant, les mesures de fluorescence à vie et FLIM sont appliquées à des fluorophores exogènes qui étiquettent biomolécules spécifiques, souvent mis en œuvre en utilisant des colorants qui tachent les compartiments cellulaires, en utilisant des colorants couplé à antibodies qui ciblent des protéines spécifiques dans les cellules fixes, ou en utilisant des fluorophores génétiquement exprimées couplés à des protéines spécifiques. Vie de fluorescence peut être utilisée pour fournir des lectures quantitatives fiables de détection des sondes fluorescentes leur environnement physique ou chimique. Pour des exemples, les colorants ont été déployés pour détecter la phase lipidique locale des membranes cellulaires 9 ou la viscosité de la cellule 10 et les biocapteurs à base de protéines fluorescentes génétiquement exprimées ont été développées pour signaler des concentrations de cellules de molécules de signalisation comprenant en IP3 11, PIP2 12 et calpaïne 13 ou des ions tels que calcium , 14,15, 16 le potassium et le chlorure 17.
Beaucoup de ces biocapteurs utilisent Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 pour fournir des lectures de changements dans la conformation de biocapteur. FRET entre «donneur» et fluorophores "accepteurs" se produit par l'intermédiaire d'une gamme courte dipôle-dipôle directe interactionpour lequel les fluorophores sont généralement séparés par moins de ~ 10 nm. Ainsi , la détection du FRET indique la proximité des protéines marquées de façon appropriée et fournit donc un moyen pour lire les interactions protéine-protéine 20 tels que la liaison ou oligomérisation – soit en tant que points d'extrémité dans des cellules fixées ou des événements comme dynamiques de mesures du décours temporel de temps réel cellules. Par marquage d' un produit d' assemblage moléculaire approprié avec des fluorophores donneur et accepteur, il est également possible de lire des changements conformationnels – ou le clivage – de la construction par l' intermédiaire de la variation de FRET et cela constitue la base de plusieurs biocapteurs 21. Mesures de l'efficacité de FRET peut fournir des informations sur la distance donneur-accepteur et la fraction de la population des fluorophores donneurs subissant FRET. Ainsi, les techniques d'imagerie à base de FRET peuvent être utilisés pour cartographier et quantifier les interactions moléculaires dans l' espace et le temps, par exemple, pour élucider la signalisation cellulaire traite 22. AutomatING ces techniques d'imagerie pourraient fournir des analyses à haut débit basé sur des lectures de voies ou de réseaux de signalisation.
Dans HCA, la lecture de FRET plus couramment mis en oeuvre est l'imagerie ratiométrique spectrale, où des changements dans le rapport de l'accepteur à l'intensité des donateurs sont mappés. Bien que cette approche est facilement mis en œuvre – et est disponible dans de nombreux disponibles dans le commerce des lecteurs de plaques multipuits – mesures de FRET résolues spectralement quantitatives nécessitent un étalonnage de la réponse spectrale du système 23. Cela inclut la diaphonie spectrale résultant de spectrale purge à travers et l'excitation directe de l'accepteur ainsi que les caractéristiques de transmission de l'instrument et l'échantillon (effet de filtre interne). En principe, cela implique la mesure des échantillons supplémentaires de «contrôle» qui sont marquées soit avec seulement donneur ou accepteur seule.
A partir de ces mesures spectrales FRET ratiométrique, une efficacité de FRETl' efficacité (le produit de l'efficacité de FRET réelle et de la fraction de molécules FRETing donneur / accepteur) peut être obtenu en même temps que la proportion relative des molécules de donneur et d' accepteur 24. FRET ratiométrique Spectral est souvent utilisé avec des biocapteurs FRET unimoléculaire, où le stoechiométrie donneur / accepteur peut être supposé connu. Pour déterminer les fractions de la population du donneur et de l' accepteur FRETing, par exemple pour obtenir une courbe dose – réponse, la connaissance de l'efficacité de FRET réel est nécessaire. Ceci peut être obtenu en mesurant un échantillon de contrôle positif de FRET avec des propriétés connues ou en utilisant une autre méthode pour mesurer l'efficacité de FRET comme accepteur photoblanchiment ou FLIM.
En utilisant la durée de vie de fluorescence des lectures, le FRET peut être détecté et quantifié par mesure de l'émission du donneur seul – en supprimant la nécessité d'un étalonnage spectral et d'autres échantillons témoins. Ainsi, les lectures FLIM FRET peuvent être comparés entre les instrumentset entre les différents échantillons – permettant les données de l' endoscopie ou la tomographie par des modèles de maladies en direct 25 être comparés à des mesures de tests cellulaires. En adaptant les profils de décroissance de la fluorescence du donneur à un modèle de décroissance multi-exponentielle appropriée correspondant à FRETing et les populations de donneurs non-FRETing, FRET efficacité et les fractions de population peuvent, en principe, être obtenus directement sans autres mesures. Ces avantages importants, cependant, viennent au prix de FLIM nécessitant des photons plus détectés par pixel que l'imagerie d'intensité résolution spectrale – généralement des centaines de photons sont nécessaires pour atteindre une précision dans la détermination de la durée de vie de 10% lors du montage d'un seul modèle de décroissance exponentielle et quand profils de fluorescence de désintégration d'ajustement à (décroissance) multiexponentielle modèles complexes, le nombre de photons détectés augmente à des milliers nécessaires. Cela a classiquement conduit à des temps d'acquisition longs (des dizaines à des centaines de secondes par domaine de la view) pour FLIM, en particulier lors de l'utilisation du temps corrélée comptage de photon unique (TCSPC) mis en œuvre avec l'acquisition de pixel séquentielle dans les microscopes à balayage laser. Les tentatives visant à augmenter la vitesse de formation d'image en utilisant des intensités d'excitation peuvent conduire à photoblanchiment et / ou de phototoxicité significative. Avec un manque d'instrumentation et des outils logiciels disponibles dans le commerce appropriés, ce qui a empêché FLIM d'être utilisé dans HCA pour la découverte ou systèmes médicaments biologie, où des centaines de milliers de champs de vue sont à imager. Le balayage laser TCSPC FLIM a été mis en œuvre dans une plaque multipuits microscope automatisé 26 pour les mesures secondaires suite à l' identification des "hits" par l' état d' équilibre de polarisation fluorescence résolue anisotropie imagerie 27, qui peut atteindre des vitesses d'imagerie similaires à l' imagerie ratiométrique spectrale 28 avec lequel il partage de nombreux avantages et inconvénients. l'imagerie de fluorescence d'anisotropie exploite la diminutiondans anisotropie de fluorescence de l'accepteur , en présence de FRET et est également sensible à la diaphonie spectrale (par exemple, l' excitation directe de l'accepteur). Il nécessite un étalonnage pour tenir compte de la polarisation diaphonie et ne fournit pas une mesure directe de l'efficacité FRET.
Pour réaliser les avantages de FLIM pour HCA, nous avons travaillé pour régler les problèmes de vitesse d'acquisition d'image et d'un accès plus large à la technologie. Ici, nous fournissons une liste complète des logiciels de source et des composants matériels ouverts qui peuvent être utilisés pour mettre en œuvre le lecteur rapide automatisé FLIM multipuits de plaque qui est décrit ci-dessous, ainsi que FRET exemplaire-analyses basées. Dans notre approche 29, FLIM est réalisée à l' aide grand champ imagerie en temps-dépendants en utilisant une gated image optique intensificateur (GOI), qui est illustrée à la figure 1 qui peut fournir de plus grandes vitesses d'imagerie et photoblanchiment inférieure à faisceau unique balayage TCSPC en raison de la interr pixel parallèleogation. Notre instrument openFLIM-HCA peut fournir FLIM sans surveillance, ne nécessitant que quelques secondes pour acquérir des données de détection FLIM quelques 100 photons par pixel ( en fonction de la luminosité de l'échantillon). Combiné avec le temps nécessaire pour déplacer l'échantillon à partir du champ précédent de vue, pour ajuster les paramètres d'acquisition et de maintenir l'échantillon au point, cela se traduit généralement en multipuits temps d'acquisition de la plaque de ~ 10 s par champ de vision 25,28. Tronçonnage optique peut être mis en œuvre en utilisant un grand champ quasi Nipkow ( "disque de filage") du scanner 30.
Pour l' analyse des données FLIM, nous avons développé un outil logiciel open source appelé FLIMfit 31 qui est capable d'analyser rapidement multipuits ensembles de données plaque FLIM sur les postes PC classiques et est un plug-in pour OMERO 32. FLIMfit fournit des capacités d'analyse globales (décrites à la section 1.2) qui permettent aux données FLIM à être montés sur des modèles complexes avec oeul quelques 100 photons par pixel sous l'hypothèse que les composantes de fluorescence à vie sont invariant sur une image ou d'une région d'intérêt (ROI), réduisant ainsi le nombre de photons détectés nécessaire, l'exposition à la lumière de l'échantillon et l'acquisition de l'image du temps. Exécution FLIMfit sur un PC de bureau standard, ne nécessite que 10s de secondes de temps de calcul pour analyser les ensembles de données comprenant des centaines de FOV. Ainsi, tant l'acquisition de données FLIM et l'analyse peuvent être entreprises sur des échelles de temps qui sont pratiques pour HCA.
matériel openFLIM-HCA
Notre mise en œuvre de FLIM HCA comprend six éléments clés: (i) un cadre de microscope à fluorescence avec autofocus optique; (Ii) un (xyz) platine de microscope motorisée; (Iii) une source laser d'excitation; (Iv) un système de FLIM temps gated grand champ avec intensificateur gated optique (GOI), générateur de retard et de la caméra; (V) un ordinateur pour l'acquisition des données et l'analyse et (vi) un dispositif de balayage de disque de Nipkowunité d'imagerie optique sectionnée pour supprimer hors de la lumière de mise au point. Cela peut être important lors de l' imagerie de signaux faibles, par exemple de biocapteurs FRET à la membrane plasmique de la cellule, pouvant être submergée par les contributions de fluorescence cytoplasmique ou fond de lamelles ou de milieu de culture. données FLIM Time-gated est acquis en éclairant l'échantillon avec le ultracourtes pulsée rayonnement d'excitation, l'imagerie de la fluorescence émission à la photocathode du GOI et l'acquisition d'une série d'images CCD du phosphore du GOI pour une gamme de paramètres de temporisation de la porte intensificateur optique après l'arrivée des impulsions d'excitation. Comme le temps de grille retard après excitation est augmentée, le signal de fluorescence est visible à diminuer et la série d'images d'intensité de fluorescence en temps-dépendants acquises sur le CCD forment l'ensemble des données nécessaires pour analyser les profils de décroissance de tous les fluorophores dans le champ de vision . Le déclenchement de l'IGE est synchronisée avec les impulsions d'excitationet, pour la série d'acquisitions CCD, le retard du temps de grille par rapport aux impulsions d'excitation est réglée sur une série de valeurs croissantes dans la plage souhaitée. Cette synchronisation est obtenue en utilisant le générateur de retard qui comprend une "boîte rapide de retard" (fournissant des retards jusqu'à 20 ns pas de 1 ps) et une "boîte de retard grossier" qui fournit des retards d'un pas minimum de 25 ps.
Pour FLIM, l'excitation peut être fournie par un laser femtoseconde. Pour plus de commodité, on emploie typiquement une source supercontinuum fibre laser à pompage qui fournit des impulsions picosecondes accordables dans le spectre visible à partir de laquelle le rayonnement d'excitation approprié peut être sélectionné pour chaque fluorophore à l'aide d'une roue de filtre motorisée avec différents filtres passe-bande. En règle générale, nous utilisons une puissance moyenne de ~ 100-200 mW à l'échantillon avec des impulsions à taux de répétition de 40 ou 60 MHz. Ces pouvoirs d'excitation pourraient également être fournis par des sources laser ultrarapides basées sur le doublage de fréquencemode verrouillé titane dopé lasers de saphir. Notez qu'une durée d'impulsion d'excitation en dessous de ~ 100 ps est suffisant pour la plupart des expériences. Une deuxième roue de filtre motorisé équipé de filtres de densité neutre est utilisée pour réguler l'intensité d'excitation. Pour plus de sécurité et de commodité, le rayonnement d'excitation peut être délivré par l'intermédiaire d'une fibre optique monomode. Les configurations pour FLIM grand champ et FLIM optiquement sectionnée sont présentés dans les figures 2 et 3 respectivement. Pour plus de détails sur les composants précis utilisés, s'il vous plaît visitez le wiki openFLIM-HCA 33. Une copie de la liste des pièces en cours est donnée dans le matériel supplémentaire.
Pour grand champ FLIM, le rayonnement d'excitation est nécessaire pour éclairer l'ensemble du champ de vue aussi uniforme que possible. Pour cela, nous dirigeons le faisceau laser d'excitation à un diffuseur holographique "chapeau" qui est mis en rotation à 10-50 Hz à moyenne temporelle de la granularité laser, avec le plan de la difl'unité de fusion étant imagée sur le plan focal arrière de l'objectif de microscope objectif. L'image de fluorescence à partir du port de sortie du microscope est relayé sur la photocathode du GOI et la substance fluorescente de la GOI (surface active diagonale de 18 mm) est imagé sur le capteur d'un capteur CCD scientifique refroidi (taille de la puce 10,2 mm x 8,3 mm) caméra à l'aide d'une paire de lentilles de caméra fournissant un grossissement de 0,7. Le système est contrôlé par un ordinateur standard qui est relié à l'instrumentation utilisant des protocoles RS232. En outre, un microprocesseur Arduino est utilisé pour commander un volet roulant dans le chemin de lumière d'excitation qui est fermée, sauf lorsque la caméra CCD est l'acquisition des données FLIM et pour enregistrer le signal provenant d'une photodiode qui est utilisé pour mesurer la puissance moyenne du supercontinuum spectralement filtrée la source d'excitation. Pour FLIM optiquement sectionnée, le rayonnement laser d'excitation est couplée dans une fibre optique monomode conservant la polarisation qui se connecte directement à l'unité de lecteur de disque de Nipkow, comme shown sur la figure 3. L'image de fluorescence de sortie de l'unité de scanner Nipkow est relayé sur la photocathode du GOI et le reste du système est le même que pour grand champ FLIM.
logiciel openFLIM-HCA
Le logiciel d'acquisition de données est écrit dans μManager 34. Il fournit des fonctionnalités d'acquisition de données complète de HCA y compris les options pour changer l'ordre dans lequel les puits de la plaque sont imagés, pour acquérir des cours à temps pour tout FOV, pour maintenir automatiquement le focus lors des mesures et pour contrôler les roues d'excitation et de filtrage d'émission et le changeur de dichroïque pour l'imagerie multicolore automatisé. Il est également possible d'exécuter une acquisition "préscan" l' intensité de fluorescence afin d'identifier automatiquement et enregistrer les positions de FOV convenables pour une acquisition FLIM ultérieure selon des critères, par exemple, en fonction de l' intensité. données HCA FLIM peuvent être enregistrés comme une sériedes fichiers TIFF, comme une série de fichiers OME-TIFF (ie, un par FOV) ou en tant que fichier OME-TIFF unique intégrant toutes les données à partir d' une plaque multipuits. Plus d' informations et une description détaillée du logiciel μManager peuvent être trouvées sur le wiki openFLIM-HCA 33.
Le logiciel d'analyse de données, FLIMfit 31, un client basé sur MATLAB open source pour l'image de OMERO plate – forme de gestion des données 32, est en mesure de lire les données FLIM à partir d' un serveur OMERO ou à partir du disque de l' ordinateur, comme indiqué sur la Figure 4. Il a été conçu pour analyser les données de TCSPC ou instruments FLIM grand champ temps fermé et offre de nombreuses possibilités pour adapter les données de openFLIM-HCA y compris raccord à monoexponentielle profils de désintégration, et de doubler les profils de désintégration complexité exponentielle et supérieur, y compris des modèles tels que profils fluorescence désintégration polarisation résolue. Il peut également tenir compte des signaux de fond fixes et variables dans le temps et peut utilize une fonction mesurée spatio-temporelle réponse de l'instrument (IRF) ou peut adapter à l'aide d'un IRF idéalisé qui peut être décalé dans le temps sur une base de pixel par pixel par une quantité déterminée à partir de la pleine mesure expérimentale IRF. Une différence de temps global (t 0) entre l'IRF et un échantillon fluorescent peut être déterminée à partir d' une mesure d'un niveau de fluorescence. Les variations spatiales dans les signaux de fond et IRF peuvent aussi être prises en compte. FLIMfit est en mesure d'adapter les données FLIM sur une base de pixel par pixel ou en utilisant "binning global" ou "ajustement global" pour faciliter le montage des données FLIM avec modestes (centaines) de photons nombre de modèles de désintégration complexes.
Binning mondiale entraîne l' agrégation de toutes les photons détectés à partir des pixels au sein d' un retour sur investissement défini par l' utilisateur à chaque point de temps pour fournir un nombre de photons suffisantes pour permettre de montage des modèles de désintégration complexes. Le retour sur investissement peut être la totalité du champ de vision (FOV), il peut être manuellement defined par l'utilisateur, ou bien elle peut être déterminée à l'aide d'outils de segmentation d'image. Le retour sur investissement peut également être défini à l' aide de masques importés dans FLIMfit d'autres logiciels de segmentation d' image. Pour les applications FRET, il est courant d'utiliser binning globale pour répondre à un double modèle de décroissance exponentielle pour déterminer les composantes de fluorescence de durée de vie correspondant à FRETing et fluorophores donneurs non-FRETing qui sont supposés être spatialement invariant à travers le ROI, puis à remonter sur un base de pixel-sage avec ces vales de composants à vie fixes afin d'obtenir la fraction de la population FRETing des donateurs dans chaque pixel.
Montage global implique raccord simultanément les composants à vie et les fractions de la population FRETing des donateurs pixel-sage à travers toute une FOV- ou à travers un ensemble de données FLIM qui pourraient comprendre plusieurs FOV, par exemple, à partir d' une expérience de plaque multipuits ou une série temporelle d'images de fluorescence à vie. raccord Global est en mesure d'exploiter la Variati spatialesur des fractions de la population à travers l'image qui est perdu dans l'approche globale de binning pour fournir des contraintes plus fortes sur l'estimation de la durée de vie composante – et donc des résultats plus fiables – mais au prix de beaucoup plus de calcul 35. FLIMfit peut analyser rapidement multipuits ensembles de données plaque FLIM avec ajustement global sur les postes de travail PC classiques avec, par exemple, un ensemble multipuits temps-dépendants données FLIM, acquis avec cinq portes de temps pour chacun des 394 FOV comprenant chacun 672 x 512 pixels, ce qui nécessite seulement 32 secondes et 2 Go de mémoire pour adapter à un modèle de décroissance exponentielle à double 31. Ceci a été réalisé en utilisant un non linéaire séparable moins d'algorithme d' ajustement carré mis en œuvre en utilisant des algorithmes parallèles multithread pour permettre détartrage efficace sur les processeurs multicœurs et le code de FLIMfit a été optimisé pour réduire au minimum l' utilisation de la mémoire. La figure 5 montre un aperçu de l'interface utilisateur graphique de FLIMfitet plus de détails peuvent être trouvés à la page Web donnée en référence 36. De plus amples informations sur le montage global et binning global peut être trouvé dans la référence 31.
Le protocole suivant pour HCA FLIM utilisant notre instrumentation et logiciels openFLIM-HCA peut être adapté à un large éventail d'expériences d'imagerie cellulaire avec affichage FLIM. En général, plaque multipuits FRET expériences doivent être conçues pour inclure des puits réplicats de contrôles biologiques positifs et négatifs, en plus des conditions à l'étude. Ici, nous décrivons la mise en œuvre spécifique à accomplir FLIM optiquement sectionnée (voir Figure 3) des cellules Cos exprimant FRET constructions consistant en la mTurquoise protéine fluorescente et Vénus protéine fluorescente rejoint par un lieur peptidique court. Ici, le mTq32V, mTq17V et mTq5V FRET constructions (discutés dans la section des résultats représentatifs) fournir à faible, moyenne et haute efficacité de FRET ainsi que le non-FRETing mTq5A construire.Ces constructions et les autres matériaux nécessaires pour suivre ce protocole sont répertoriés dans la liste des matières.
Nous avons décrit un microscope à plaque multipuits automatisé conçu pour HCA en utilisant FLIM temps-dépendants. Cet instrument est contrôlé en utilisant un logiciel open source écrit en μManager avec la possibilité d'enregistrer les données sur un serveur OMERO et l'analyse des données de FLIM entrepris en utilisant FLIMfit 36, un programme open source écrit en MatLab et disponible en tant que client OMERO 32 L'instrument μManager logiciel de contrôle, openFLIM-HCA, est disponible en ligne 33 avec une liste des composants du système 48 pour permettre aux chercheurs universitaires de construire leurs propres instruments FLIM HCA.
Afin d'acquérir des données de FLIM robustes, il est nécessaire d'optimiser les paramètres d'acquisition GOI et CCD et de tenir compte de toutes les variations de t 0. Comme décrit dans 3.8.2, le réglage de gain et une caméra CCD temps d'intégration GOI devrait être réglé pour atteindre ~ 75% de la gamme dynamique de CCD. Uchanter plus élevés tensions GOI et plusieurs accumulations de cadre CCD à chaque retard de porte de temps augmente le rapport signal sur bruit 49 mais cela augmente le temps d'acquisition de FLIM totale (depuis moins de photons de fluorescence sont acquises par trame avant les sature de la caméra CCD et donc le nombre d'accumulations de cadre devrait être augmenté) et donc ce compromis devrait être décidée pour chaque expérience. L'étalonnage du générateur de retard dépend de la fréquence de répétition du laser et il est donc nécessaire de faire en sorte que le fichier d'étalonnage correct pour la vitesse de répétition utilisée est chargée dans le logiciel d'acquisition. La procédure de calibrage de la boîte de retard peut être trouvé sur le wiki openFLIM-HCA 33.
Si l'autofluorescence cellulaire est faible par rapport au signal de fluorescence, nous utilisons le signal d'un juste milieu de culture contenant bien de fournir le contexte variant dans le temps (TVB). Pour réduire au minimum la fluorescence de fond à partir du milieu de culture cellulaire, on évitedes milieux contenant du rouge de phénol. Si l'auto-fluorescence cellulaire est importante, la TVB peut être dérivée de mesures des cellules non marquées. Cependant, dans ce cas, il faut prendre soin, car cela suppose que l'arrière-plan d'autofluorescence est le même pour chaque pixel de l'image. Cette hypothèse ne sera pas valide si le autofluorescence varie considérablement d'une cellule ou si le faisceau d'excitation ou de la sensibilité de détection est pas uniforme sur le champ de vision.
L'acquisition d'une image en utilisant IRF dispersés impulsions de lumière d'excitation fournit le profil IRF temporelle qui est convolution avec le modèle de données dans le processus de montage et prévoit également une carte de la variation spatiale de l'IRF à travers le champ de vision. FRI peut être mesurée par imagerie d'un échantillon de la dispersion telle qu'une suspension colloïdale, bien que, dans notre instrument, en utilisant une lumière d'excitation diffusée à partir du disque de Nipkow fournit une mesure propre de l'IRF. La détermination précise du moment of l'IRF est important parce que les erreurs dans le délai entre l'excitation et le temps de déclenchement peuvent avoir un impact significatif du processus d'ajustement, en particulier lors du montage à des modèles complexes de décroissance exponentielle. L'IRF a acquis en utilisant la lumière d'excitation diffusée est pas exactement ce qui est nécessaire pour le processus d'ajustement, car il est enregistré à la longueur d'onde d'excitation plutôt que la longueur d'onde d'émission de fluorescence, ce qui peut affecter son timing, bien que la variation spatiale de l'IRF doit être le même aux deux longueurs d'onde. En outre, l'IRF dispersée peut être déplacé globalement en temps par rapport à la véritable IRF en raison d'une longueur de trajet optique différente de l'objet de diffusion, comme cela est le cas pour un IRF acquis à partir du disque Nipkow en FLIM optiquement sectionnée. Cette correction, t 0, ce qui est le décalage temporel global nécessaire qui devrait être appliqué à l'IRF dispersés de lumière d'excitation acquise, est calculée à partir des données de colorant de référence monoexponentielles comme indiqué dans Protocol étape 4.4. Les colorants suivants peuvent être utilisés pour différentes longueurs d' onde d'excitation: une coumarine 153 solution à 75 uM dans du methanol (4,3 ns τ ~ 50) peut être utilisé pour l' excitation dans la gamme de 295-442 nm; une 6 solution à 75 uM coumarine dans l' éthanol (2,43 ~ T pour ns 37) peuvent être utilisés pour l' excitation dans la gamme 430-500 nm; et une solution à 75 uM de rhodamine B dans l' eau (τ ~ 1,7 ns 37) peut être utilisé pour l' excitation dans la gamme 488-575 nm. Nous notons que, bien qu'il soit possible de FLIMfit utiliser un autre IRF pour chaque pixel du système, généralement , il est raisonnable de faire l'hypothèse que l'IRF variant spatialement a le même profil temporel pour chaque pixel de l'image , mais présente une gamme des décalages temporels variant spatialement par rapport à la t globale 0. Nous décrivons ce que la carte de décalage IRF, qui est déterminée à partir de l'IRF de la lumière diffusée. Ensemble, le profil IRF, t 0 et la carte IRF de décalage sont utilisés pour enen sorte que chaque pixel dans le champ de vision est équipée d'un IRF approprié. Surtout, t 0 peut varier lentement au fil du temps de sorte qu'il doit être mesurée avant toute acquisition de données FLIM.
L'utilisateur doit décider comment échantillonner profils de désintégration des fluorescence et est nécessaire pour définir la largeur des temps-portes et leurs retards relatifs après excitation. D'une manière générale, il est souhaitable d'utiliser des grandes largeurs de grille afin de maximiser le signal détecté et typiquement on utiliser des largeurs de grille fixées à 4 ns pour FLIM de cellules marquées aux protéines fluorescentes. Le nombre de temps à grille des retards devrait être suffisant pour échantillonner le profil fluorescent de décroissance (y compris une porte fixé pour mesurer le signal juste avant l'impulsion d'excitation) compte tenu de la complexité de l'ajustement du modèle qui sera utilisé dans l'analyse. La valeur optimale peut dépendre de la durée de vie et les amplitudes relatives des composants de désintégration. En général, 4 portes sont suffisantes pour monoexponentielle raccord désintègre alors 7 ou plusieurs portes peuventêtre utilisé pour d'autres modèles de désintégration complexes.
Nous notons que FLIM peut être implémentée en utilisant une gamme de techniques dans le domaine temporel ou dans le domaine fréquentiel et automatisé HCA FLIM de réseaux de plaques multipuits a été mis en œuvre d' abord dans un (non-tronçonnage) grand champ microscope en utilisant des lectures domaine fréquentiel à vie de FRET 51. La première optique tronçonnage FLIM lecteur de plaques multipuits automatisé pour HCA utilisant grand champ time-gated imagerie 28 a ensuite été signalé. Par la suite, à grand champ (non-tronçonnage) domaine fréquentiel FLIM HCA a été appliqué à l' écran pour modifications post traductionnelles (tyrosine phosphorylation) à travers une banque de gènes en utilisant FRET 52 et le temps-gated FLIM HCA a été appliqué à FRET tests de HIV-1 Gag 53 oligomérisation et de sumoylation de FOXM1 54 et Raichu RhoA et Rac1 biocapteurs 33. Il est également possible d'utiliser TCSPC pour multipuits plaque FLIM 26 mais à ce jour il est apparu difficile de faire correspondre til débit de techniques exploitant la détection à grand champ. Une approche émergente qui pourrait résoudre ce problème est l'utilisation de tableaux de simples détecteurs de comptage de photons tels que des tableaux de SPAD 55.
Nous notons que les lectures de FRET utilisant des protéines fluorescentes doivent être traités avec prudence et que les valeurs absolues des paramètres obtenus à partir de FLIMfit ou tout autre logiciel d'analyse FLIM dépendra des hypothèses associées à l'ajustement du modèle. Par exemple, lorsque le donneur de FRET a une deuxième composante importante de décroissance, l'utilisation d'un modèle biexponentielle pour ajuster les données FRET FLIM peut entraîner la contribution de la composante décroissance plus rapide, généralement associé à la population FRETing apparaissant plus élevée qu'elle ne le devrait. Il est donc souhaitable d'utiliser des donneurs avec une durée de vie mono-exponentielle telle que mTq2FP. Même alors, des études récentes ont montré que l'analyse FRET peut encore être affectée par les états sombres de protéines de fluorescence de l'accepteur ou parhétérogénéité du facteur d'orientation κ 2 en raison d'une distribution de conformations fluorophores avec une variété d'angles et les distances chromophores 56. Néanmoins, nous et d'autres ont montré que la durée de vie de fluorescence des lectures de FRET produisent des résultats utiles qui sont en corrélation avec les mesures biochimiques et peuvent être utilisés pour dépister les interactions entre protéines ou de suivre la dynamique de biocapteurs. Ainsi , cette plate – forme HCA openFLIM peut être appliqué à une large gamme de dosages basés sur la durée de vie de fluorescence, FRET utilisant l' autofluorescence cellulaire ou 8, ainsi que fournir des lectures quantitatives des sondes à base de colorants 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |