인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
일 주기성 시계는 일일 환경 변화를 예측하여 외부 세계에 적응을 허용, 모든 빛에 민감한 생물에서 기능입니다. 주기성 시계와 생리학의 대부분의 측면 사이의 긴밀한 연결에 대한 우리의 이해에 상당한 진전이 지난 10 년 동안 현장에서했다. 그러나, 인간의 주기성 발진기의 기능의 기초가되는 분자 기초를 푸는 것은 가장 높은 기술적 인 문제로 남아 있습니다. 여기서는 차 배양 된 세포에서 장기간 (2-5일) 생물 발광 기록 유출 매체 수집 실험 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이를 위해, 우리는 호르몬 분비 주기성 생물 발광들의 병렬 평가를 허용하는 코어 클록 유전자 프로모터의 제어하에있는 루시페라아제 리포터 렌티 일차 세포를 형질 도입 하였다. 더욱이, 우리는 홍보 주기성 시계를 방해하는 조건을 기술siRNA를 대상으로 시계를 형질 감염에 의해 imary 인간 세포. 인간의 췌장에 의한 인슐린 분비의 일주기 조절에 대한 연구 결과, 인간의 골격 근육 세포에 의해 myokine 분비,이 방법론의 응용 프로그램을 설명하기 위해 여기에 제시되어있다. 이러한 설정은 인간 말초 시계 분자 메이크업 공부 또는 병태 생리 학적 조건 하에서 일차 세포에 미치는 기능적 영향을 분석하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
(라틴어 "년경 디엠"에서) 주기성 타이밍 시스템은 지구의 회전에 적응 메커니즘으로, 모든 빛에 민감한 생물에 등장했다. 포유 동물에서, 복부 시상 하부의 시교 차 상핵에 위치해 중앙 시계를 포괄, 계층 적 방식으로 조직하고, 주변 (또는 슬레이브) 다른 기관에서 동작한다 발진기. 또한, 이러한 세포 자율적 인 자기 유지 발진기는 본체 (1)의 거의 모든 세포의 기능입니다. SCN에서 나오는 신경과 체액 신호가 주변 시계를 재설정 반면 빛의 신호는 SCN 신경 세포에 대한 지배적 인 동기 큐 (Zeitgeber)를 나타냅니다. 차례 먹이-금식 사이클에서 운전 외에 나머지 활동 리듬에서, 주변 시계 2에 대한 더 싱크로 나이저입니다. 현재의 이해에 따르면, 코어 클록의 분자량 화장 전사 및 transla에 기초생물 사이에 보존된다적인 피드백 루프. 이 함께 음의 코어 클럭 PER과 CRY 유전자의 전사를 활성화 전사 활성화 BMAL1 및 CLOCK을 포함한다. PER 및 CRY 단백질의 높은 수준은 BMAL1 / CLOCK 복합체의 억제를 통해 자신의 전사를 억제한다. 보조 루프는 또한 BMAL1 및 CLOCK의 전사를 조절하는 핵 수용체 REV-ERBS 및 RORS로 구성되어 있습니다. 또한, 인산화 sumoylation, 아세틸, O-GlcNAcylation 분해 및 코어 클록 입력 단백질 핵 포함 번역 후 이벤트는 24 시간 진동주기 3 확립 추가적인 중요한 조절 층을 나타낸다.
축적 증거는 설치류 모델 연구에서 줄기와 신진 대사 및 내분비 기능 4-5의 조정의 일 주기성 시스템의 중요한 역할을 강조한다. larg의 다수의금식 사이클 주변 발진기 6-8의 동기화에 중심적인 역할을 – 전자 규모의 사체 분석 수유하는 것이 좋습니다. 이러한 연구와의 계약에서, 설치류와 인간의 대사 체 및 lipidomic 분석은 대사의 많은 수는 주기성 방식 9-11에서 조직, 혈장, 타액으로 진동 것으로 밝혀졌다. 중요한 것은, 대부분의 호르몬은 혈액 5,12-13에서 활동 일주기를 나타낸다. 또한, 말초 조직의 제조 대응 호르몬 주기성 시계 로컬 호르몬 분비를 조절할 수있다. 셀 자치 일중 발진기는 설치류와 인간의 췌장 섬 세포를 14 ~ 16에 기재되어있다. 이 발진기는 췌장 섬의 사체를 조절하는 중요한 역할을 담당하고 15,17-18를 작동합니다. 또한, 인간의 골격 myotubes에 의해 myokine 분비는 최근 세포 자치 oscillato에 의해 조절되는 주기성 패턴을 나타내는 것으로 입증되었다이러한 셀 (19)의 동작 RS.
생체 내에서 인간 활동 일주기를 연구하기위한 여러 접근 방식이 널리 사용되어왔다. 예를 들어, (참조 3,20 검토) 플라즈마 멜라토닌 코티솔 수치뿐만 아니라 흉부 피부 표면 온도는 내인성 일 주기성 시계를 평가하기 위해 연구되어왔다. 이 방법은 생체 내에서 전신 주기성 진동을 연구 할 수 있지만, 그들은 지금까지 다른 장기와 조직에없는 실행 자율적 인 활동 일주기의 신뢰성있는 평가를 제공부터입니다. 그럼에도 불구하고, 전신 규제에서 이러한 박리는 이들 세포의 기능을 세포 내 분자 시계의 구체적인 효과를 이해하기위한 필수 도구가 될 것이다. 따라서, 상당한 노력이 시험 관내에서 동기화 불멸화 또는 일차 배양 된 세포에서 인간의 시계를 연구하기위한 신뢰할 수있는 방법을 개발하기 위해 수행되었다. 중요한 것은, 그 입증되었다일차 배양 된 피부 섬유 아세포에서 측정 클럭 특성에 밀접 전체 유기체 (21)의 각각의 클럭 특성을 반영한다. 형광 및 발광 생물의 circadian 기자의 개발은 크게이 방법 22-27 고급있다. 또한, 다른 말초 기관에서 파생 된 공부 일차 전지 시계는 인체 조직 별 시계 3,5,16,19-20,28의 분자 특성의 조사를 할 수 있습니다. 따라서, 체외 동기화 기본 외식 또는 셀의 일 주기성 시계의 평가는 생물 발광 기자를 사용하여, 분자 인간 말초 시계의 메이크업과 장기의 기능에 미치는 영향을 연구 할 수있는 매우 유용한 방법을 나타냅니다.
이 글에서, 우리는 자율적 인 휴대 시계의 영향뿐만 아니라 체외에서 동기화 인간의 주요 섬과 골격 근육 세포에서 일 주기성 유전자 발현을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다이러한 세포의 분비 기능에 장애가 발생했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 실험 설정은 다음 체외 동기화 및 며칠 동안 생물 발광의 연속 기록, 같은 세포에 의한 호르몬 분비의 병렬 분석 한 다음, 배양 된 인간의 기본 세포로의 circadian 생물 발광 기자의 렌티 바이러스 전달로 구성된다. 그들은 분자 메커니즘과 인간의 일차 전지에 주기성 시계의 기능적인 측면을 탐구하기위한 효율적인 접근 방식을 나타냅니다.
도너 재료의 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제네바 대학에서 우리의 동료에게 감사 : 자크 필립이 작품에 대한 건설적인 의견, 그리고 Ueli Schibler perifusion 시스템의 개발 및 과학 영감을 귀중한 도움을 설계, 제조 및 시운전 생각하는 데에 대한 앙드레 Liani 관류 시스템의 perifusion 시스템 및 누수 biolumicorder 소프트웨어 개발에 도움을 LESA-기술 LTD 회사, 조지 SEVERI는 perifusion 실험에 대한 지원을 위해, 우르술라 Loizides-만 골드는 대한 비판적 렌티 바이러스 제제에 대한 원고를 읽기, 앤 – 마리 Makhlouf ; 에티엔 느 Lefai, 스테파니 Chanon 및 휴 버트 비달 (INSERM, 리옹) 인간의 기본 근육 아세포를 제조하는 단계; 인간의 독도를 제공 도메니코 보스코와 티에리 Berney (인간의 작은 섬 이식 센터, 제네바 대학 병원)에. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 번호에 의해 투자되었다 31003A_146475 / (1),시nergia 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 번호 CRSII3-154405, 파운데이션 부문로만 드 라 공들인 쉬르 Diabète, 보 Hjelt 재단, 파운데이션 부문 에른스트 외 루시 Schmidheiny, 그리고 소시 Académique 드 제네바 (CD)를 붓는다.
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
Referencias
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