Mesure parallèle d'expression Circadian Clock génique et la sécrétion d'hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Le système de chronométrage circadien (du latin "Circa diem") a vu le jour dans tous les organismes sensibles à la lumière, comme un mécanisme d' adaptation à la rotation de la Terre. Chez les mammifères, elle est organisée de façon hiérarchique, qui englobe l'horloge centrale, qui est située dans le noyau suprachiasmatique de l'hypothalamus ventrale et périphérique (ou esclave) qui sont des oscillateurs fonctionnant dans différents organes. En outre, ces oscillateurs autonomes auto-entretenues cellules sont fonctionnelles dans presque toutes les cellules du corps ^1. Signaux photiques représentent un signal de synchronisation dominant (Zeitgeber) pour les neurones du RCS, alors que les signaux neuronaux et humorale émanant du SCN réinitialiser les horloges périphériques. En addition des rythmes de repos-activité, qui poussent dans les cycles d'alimentation à jeun tour, sont d' autres synchroniseurs pour horloges périphériques ^2. D'après les connaissances actuelles, la composition moléculaire de l'horloge de base est basée sur la transcription et traducboucles de rétroaction tions, qui sont conservées entre les organismes. Cela comprend les activateurs de transcription BMAL1 et CLOCK, qui activent ensemble la transcription des gènes négatifs noyau horloge PER et CRY. Des niveaux élevés de PER et de protéines CRY inhibent leur propre transcription par l'inhibition du complexe / CLOCK BMAL1. Une boucle auxiliaire se compose des récepteurs nucléaires REV-Erbs et reurs, qui régulent également la transcription de BMAL1 et CLOCK. En outre, les événements post – traductionnelles , y compris la phosphorylation, sumoylation, acétylation, O-GlcNAcylation, la dégradation et l' entrée nucléaire des protéines noyau d'horloge représentent une couche supplémentaire de régulation important dans l' établissement du cycle d'oscillation 24 h ^3.

L'accumulation des données provient des études dans des modèles de rongeurs et met en évidence le rôle critique du système circadien dans la coordination des fonctions métaboliques et endocriniens ^4-5. Un certain nombre de large-échelle de l' analyse du transcriptome suggèrent que l' alimentation – cycles de jeûne jouent un rôle central dans la synchronisation des oscillateurs périphériques ^6-8. En accord avec ces études, l' analyse métabolomique et lipidomiques chez les rongeurs et les humains ont révélé qu'un grand nombre de métabolites osciller dans les tissus, le plasma et la salive d'une manière circadien ^9-11. Fait important, la plupart des hormones présentent des rythmes circadiens dans ^5,12-13 de sang. En outre, les horloges circadiennes de l'hormone correspondante produisant des tissus périphériques pourraient réguler la sécrétion d'hormones localement. Oscillateurs circadiens cellulaires autonomes ont été décrits dans les rongeurs et les cellules des îlots pancréatiques humains ^14-16. Ces oscillateurs jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'îlot transcriptome du pancréas et de la fonction ^15,17-18. En outre, la sécrétion Myokine par myotubes squelettiques humains a été démontré récemment pour présenter un modèle circadien, qui est régulée par oscillato cellulaire autonomers opératoires dans ces cellules ^19.

Plusieurs approches pour l' étude des rythmes circadiens chez les humains in vivo ont été largement utilisés. Par exemple, la mélatonine plasmatique ou les niveaux de cortisol, ainsi que thoracique température de surface de la peau (revue dans les références ^3,20) ont été étudiés pour évaluer horloges circadiennes endogènes. Bien que ces méthodes permettent d' étudier les oscillations circadiennes systémiques in vivo, ils sont loin de fournir une évaluation fiable des rythmes circadiens autonomes libres fonctionnant dans différents organes et tissus. Néanmoins, une telle dissection de la régulation systémique serait un outil indispensable pour la compréhension de l'effet spécifique des horloges moléculaires intracellulaires sur la fonction de ces cellules. Par conséquent, un effort important a été entrepris pour développer des approches fiables pour l' étude des horloges humaines dans des cellules cultivées immortalisées ou primaires synchronisées in vitro. Surtout, il a été démontré quecaractéristiques d'horloge mesurées dans des cellules de fibroblastes primaires de peau en culture reflètent étroitement les propriétés d'horloge individuelles de l'ensemble de l' organisme ^21. Le développement des reporters circadiens fluorescents et bioluminescentes a considérablement avancé cette approche ^22-27. En outre, l' étude des horloges de cellules primaires qui sont dérivées de différents organes périphériques permet l'étude des propriétés moléculaires des horloges spécifiques de tissus humains ^{3,5,16,19-20,28.} Ainsi, l' évaluation des horloges circadiennes dans explants in vitro ou les cellules primaires synchronisées, en utilisant les journalistes bioluminescentes, représente une méthode très utile pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et leur impact sur le fonctionnement des organes.

Dans cet article, nous présenterons des protocoles détaillés pour l' évaluation de l' expression du gène circadien dans les cellules des îlots pancréatiques primaires et les muscles squelettiques humains synchronisés in vitro, ainsi que l'impact de l' horloge cellulaire autonomela perturbation de la fonction de sécrétion de ces cellules.