Summary

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

Como parte do sistema natural killer imune inata (NK) contribuir para a primeira linha de defesa contra as células infectadas com vírus ou transformadas de forma maligna. Um sistema de receptores inibidores e activadores lhes permite distinguir entre células transformadas e saudáveis ​​sem escorva antigénio antes em contraste com as células T. No momento do encontro célula alvo células NK liberar o conteúdo de seus grânulos citotóxicos (por exemplo, perforina, Granzimas) na sinapse imunológico para matar seu alvo. Além disso, as células NK produzem e segregam diferentes tipos de citocinas (por exemplo, interferão-y: IFN-γ; Factor de Necrose Tumoral-α: TNF-α) e quimiocinas (por exemplo, proteína inflamatória de macrófagos-1β: MIP-1b) sobre células alvo interacção citocina ou uma estimulação.

Suficientes funções das células NK, tais como citotoxicidade, quimiocinas e produção de citocinas têm um impacto importante sobre o destino de diversas disfacilita. Pacientes com leucemia mostram taxas de recaída aumenta se eles apresentam um perfil de célula NK com defeito no momento do diagnóstico consiste em produção de IFN-γ reduzida e redução da expressão de ativação de receptores 2 células NK. Uma recuperação rápida do número de células NK e do funcionamento, incluindo a produção de citoquinas após interacção célula alvo está associada com uma recaída reduzida e uma melhor taxa de sobrevivência em doentes que receberam transplante de células estaminais alogénicas 3. Além disso, no início da terapêutica interferon em pacientes infectados pelo vírus da hepatite C a capacidade desgranulação das células NK periféricas é mais forte nos primeiros respondedores do que em não-respondedores 4. O número de células NK (> 80 / l) no dia 15 após o transplante de células-tronco autólogas (autoSCT) em pacientes que sofrem de linfoma ou mieloma múltiplo são preditivos de uma melhor progressão livre e de sobrevida global 5. Em pacientes com melanoma, a expressão de a-célula T immunoglobulin- e mucina-domínio-contendg molécula-3 (TIM-3), uma proteína imuno-reguladora das células NK, correlaciona-se com a fase da doença e o prognóstico 6.

Os cientistas têm monitorado as funções das células NK ao longo das últimas décadas. A análise inicial da citotoxicidade das células NK contra células tumorais sem escorva antes foi abordada utilizando um ensaio de libertação de 51Cr-7. Mais recentemente, os cientistas desenvolveram um método não-radioactivos para avaliar a citotoxicidade das células NK expandidos 8. Citocina e quimiocina produção tem sido frequentemente avaliado utilizando um ensaio de imunossorvente ligado técnicas a enzima (ELISA) 9,10. Durante as últimas décadas, estes métodos têm sido completada pelo fluxo de ensaios baseados em citometria. A utilização de inibidores de proteína de transporte (por exemplo, brefeldina A e monensina) e métodos de permeabilização celular em combinação com protocolos de coloração de superfície convencionais, permitiram aos cientistas estudar quimiocina e a produção de citocinas em diferentes linfa específicasubconjuntos ocyte (por exemplo, T, B ou células NK) 11. Além disso, ensaios baseados em citometria de fluxo diferentes têm sido desenvolvidos para monitorizar a citotoxicidade das células T e NK. Em 2004 Alter et ai. Descreveu a expressão de superfície da proteína associada ao lisossoma CD107a (LAMP1) em células NK mediante encontro de células alvo como um marcador para a desgranulação dos grânulos citotóxicos 12. Uma vez que uma ampla gama de diferentes fluorocromos e citómetros de fluxo multi-canal estão disponíveis nos nossos dias, tornou-se possível monitorizar simultaneamente diversas funções das células NK (citotoxicidade, produção de citoquinas e de quimioquinas) em diferentes subpopulações de células NK. Isto torna-se especialmente importante em situações em que o tamanho da amostra é limitado, por exemplo, em biopsias ou amostras de sangue de pacientes que sofrem de leucopenia.

Para testar as funções das células NK globais, os ensaios baseados em citometria de fluxo diferente pode ser eficientemente combinada. Theorell et al. Células NK estimuladas de headoadores imunda com a linha de células tumorais K562 e analisados a desgranulação das células, o sinal de dentro para fora e de quimiocina produção NK através de citometria de fluxo 13. Recentemente subgrupos de células NK, fenótipos e funções em pacientes com tumor durante autoSCT foram analisados ​​por meio de fluxo ensaios baseados em citometria. Demonstrou-se que as células NK foram capazes de produzir desgranulam e citocinas / quimiocinas sobre o reconhecimento de células de tumor em tempos precoces depois autoSCT 11.

Aqui é descrito um protocolo para avaliar as funções das células NK após interacção com células tumorais, incluindo a capacidade de desgranulação, produção de quimioquina e citoquina utilizando um fluxo de ensaio à base de citometria que faz com que seja possível controlar as funções das células NK em subconjuntos diferentes simultaneamente.

Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do comitê de ética local da Universidade de Frankfurt. 1. Cultura de células K562 Cultura de células K562 em meios R10 (RPMI 1640 com meio de glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 10% de soro fetal de vitela) a uma densidade de 0,5-1 x 10 6 culas por ml num balão de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2. Células colheita K562 24 h antes do início de uma nova experiência. Retirar o f…

Representative Results

A estratégia de propagação para analisar a desgranulação, produção de citoquinas e de quimioquinas de toda a população de células NK e três subconjuntos de células NK diferentes estão ilustradas na Figura 1. Os resultados representativos de um dador saudável estão ilustrados na Figura 2. As células NK sem qualquer estímulo produzido nem IFN-γ nem MIP-1β e não manifest…

Discussion

O método descrito é um método fácil, rápido e fiável para estudar as funções das células NK, a partir de amostras de sangue completo de dadores saudáveis ​​ou de pacientes. Este método oferece a grande vantagem de purificar as células NK directamente a partir de sangue total, evitando o demorado centrifugação em gradiente de densidade, que é obrigatória em muitos outros métodos de purificação 15. Além disso, requer um menor tamanho da amostra em relação ao "clássico" de is…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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Citar este artículo
Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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