Summary

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

במסגרת ההרג הטבעי מערכת חיסון המולדת (NK) תאים לתרום קו ההגנה הראשון נגד שנדבק בנגיף או רע ומר טרנספורמציה תאים. מערכת של קולטנים מעכב והפעלה מאפשרת להם להבחין בין תאים בריאים טרנספורמציה ללא תחול אנטיגן לפני בניגוד לתאי T. לאחר מפגש תא המטרה תא NK לשחרר את התוכן של הגרגרים שלהם ציטוטוקסיות (למשל, perforin, granzymes) לתוך הסינפסה החיסונית להרוג היעד שלהם. יתר על כן, תאי NK מייצרים ומפרישים סוגים שונים של ציטוקינים (למשל, γ interferon-: IFN-γ; הגידול נמק-α גורם: TNF-α) וכמוקינים (למשל,-1β חלבון דלקתי מקרופאג: MIP-1β) על תא המטרה אינטראקציה או ציטוקינים גירוי 1.

מספיק פונקציות תא NK כגון רעילות, chemokine וייצור ציטוקינים יש השפעה חשובה על גורל דיס מגווןמקל. חולי לוקמיה להראות גדל בשיעור ההתקפים אם הם מפגינים פרופיל תא NK פגום בעת האבחנה המורכב של ייצור IFN-γ מופחת התבטאות מופחתת של הפעלת 2 לקולטנים המצויים בתאי NK. התאוששות מוקדמת של מספרים הסלולריים NK ותפקוד כולל ייצור ציטוקינים על אינטראקצית תא המטרה קשורה להרע מופחת שיעור הישרדות משופר בחולים מקבל השתלת תאי גזע אלוגנאית 3. יתר על כן, על התחלת טיפול אינטרפרון בחולים שנדבקו בנגיף הפטיטיס C קיבולת degranulation של תאים היקפיים NK הוא חזק המגיבים מוקדם מאשר שלא הגיבו לטיפול 4. מספרי תא NK (> 80 / μl) ביום 15 לאחר השתלת מח עצם אוטולוגית (autoSCT) בחולים הסובלים מלימפומה או מיאלומה נפוצה הם המנבאים התקדמות משופרת חופשית הכוללת הישרדות 5. בחולים מלנומה הביטוי של T-cell immunoglobulin- ו mucin-מושלם-containinמולקולת -3 G (TIM-3), חלבון חיסוני רגולציה על תאי NK, עולה בקנה אחד עם שלב מחלה והפרוגנוזה 6.

מדעני פיקוח פונקציות תא NK לאורך העשורים האחרונים. הניתוח הראשוני של cytotoxicity תא NK כנגד תאים סרטניים ללא תחול לפני טופל באמצעות assay 51 Cr-שחרור 7. לאחרונה, מדענים פתחו שיטה שאינה רדיואקטיבי כדי להעריך את הרעילות של תאי NK המורחבים 8. ייצור ציטוקינים ו chemokine נבדק לעתים קרובות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) טכניקות 9,10. במהלך העשורים האחרונים שיטות אלה כבר כהשלמת מבחני זרימה מבוססת cytometry. השימוש מעכבי תחבורת חלבון (לדוגמא, brefeldin ו monensin) ושיטות התא permeabilization בשילוב עם פרוטוקולים מכתימים קונבנציונלי שטח אפשר למדענים לחקור chemokine וייצור ציטוקינים ב הלימפה ספציפית שונהתת ocyte (למשל, T, B או תאי NK) 11. יתר על כן, מבחני cytometry מבוסס זרימה שונה פותחו כדי לפקח T ו- NK cytotoxicity תא. בשנת 2004 אלתר ואח. תאר את ביטוי השטח של החלבון ליזוזום הקשורים CD107a (Lamp1) על תאי NK על מפגש תא המטרה כסמן עבור degranulation של גרגרי ציטוטוקסיות 12. מאז מגוון רחב של fluorochromes השונה cytometers זרימת רב ​​ערוצית זמין בימינו, זה הפך להיות אפשרי לפקח בו זמנית פונקציות תא NK מגוונות (cytotoxicity, ציטוקינים וייצור chemokine) תת תאים שונים NK. זה הופך להיות חשוב במיוחד במצבים בהם גודל המדגם מוגבל, למשל, ב ביופסיות או דגימות דם של חולים הסובלים לויקופניה.

כדי לבדוק פונקציות תא NK העולמיות, מבחני הזרימה השונה מבוסס cytometry ניתן לשלב ביעילות. Theorell et al. תאי NK מגורה מ heaתורמי lthy עם קו התאים הסרטניים K562 ונותח degranulation תא NK, ייצור אות ו chemokine מבפנים החוצה באמצעות זרימת cytometry 13. לאחרונה תת-קבוצות תא NK, פנוטיפים ופונקציות בחולי גידול בזמן autoSCT נותחו באמצעות לזרום מבחני cytometry מבוססים. זה הודגם כי תאי NK הצליחו degranulate ולייצר ציטוקינים / כמוקינים בעת ההכרה תאים סרטניים בנקודות מוקדם מאוד זמן אחרי autoSCT 11.

הנה פרוטוקול מתואר להעריך פונקציות תא NK על אינטראקציה עם תאים סרטניים כוללים קיבולת degranulation, chemokine וייצור ציטוקינים באמצעות זרימה cytometry המבוסס assay זה עושה את זה ניתן לבצע מעקב אחר פונקציות תא NK תת שונים בו זמנית.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות של ועדת האתיקה המקומית מאוניברסיטת פרנקפורט. 1. Culturing של תאי K562 K562 תאים תרבות בתקשורת R10 (RPMI1640 עם המדיום גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10% נסיוב עגל עוברית) בצפיפות…

Representative Results

האסטרטגיה gating לניתוח degranulation, ציטוקינים ו chemokine הייצור של האוכלוסייה התא כולו NK ושלושה תת תא NK שונים הם באיור 1. תוצאות נציג התורם אחד בריא הם באיור 2. תאי NK ללא כל גירוי הפיק …

Discussion

השיטה המתוארת היא גישה קלה, מהירה ואמינה ללמוד פונקציות תא NK מדגימה דם שלם של תורמים או מטופלים בריאים. שיטה זו מציעה את היתרון הגדול לטהר תאי NK ישירות מדם כולו, הימנעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות זמן רבה, שהיא חובה עבור שיטות טיהור רבות אחרות 15. יתר על כן, זה דורש גוד…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

Referencias

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Play Video

Citar este artículo
Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

View Video