Непосредственное определение характеристик гидратированных белков в воде SALVI и TOF-SIMS
Summary
Эта работа представляет собой протокол для жидкого обработки и ввода пробы для микроканале для на месте времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрического анализа белковых биомолекул в водном растворе.
Abstract
Эта работа демонстрирует Непосредственное определение характеристик белковых биомолекул в водном растворе при помощи системы для анализа на жидкостные вакуумные интерфейса (SALVI) и времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрии (TOF-SIMS). Фибронектин белок фильм был иммобилизован на нитрид кремния (SiN) мембраны, которая формирует зону обнаружения SALVI. При анализе ToF-SIMS, были проведены три режима анализа в том числе высокое пространственное разрешение масс-спектрометрии, двумерный (2D) изображений, и глубине профилирования. Масс-спектры получали в положительных и отрицательных режимах. Деионизированную воду также анализировали качестве образца сравнения. Наши результаты показывают, что фибронектин пленка в воде имеет более четкие и сильные воды кассетные пики по сравнению с водой в одиночку. Характерные пики фрагментов аминокислотных также наблюдаемая в гидратированном белка спектров ToF-SIMS. Эти результаты показывают, что адсорбция молекула белка на поверхности могут быть изучены DynamicaLLY использованием SALVI и TOF-SIMS в жидкой среде впервые.
Introduction
Гидратация имеет решающее значение для структуры, 1 конформации, 2 и биологической активности 3 белков. Белки без молекул воды вокруг них не было бы жизнеспособных биологических активностей. В частности, молекулы воды взаимодействуют с поверхностью и внутренней структуры белков, а также различные гидратации состояния белков сделать такие взаимодействия различны. 4 Взаимодействие белков с твердыми поверхностями является фундаментальным явлением с последствиями в области нанотехнологий, биоматериалов и тканевой инженерии процессов. Исследования уже давно показали, что конформационные изменения могут происходить как белок обнаруживает поверхность. ToF-SIMS было предусмотрено как метод, который имеет потенциал для изучения белок твердый интерфейс. 5-7 Важно понимать гидратации белков на твердых поверхностях, которые потенциально обеспечивает глубокое понимание механизма их структуры, конформации, и биологическаяаль деятельность.
Тем не менее, основной поверхности аналитические методы в основном вакуумной основе и прямые заявки на летучих жидких исследований сложно из-за быстрого испарения летучей жидкости под вакуумной среде. Мы разработали вакуум совместимы Микрожидкостных интерфейс, система анализа на жидкий вакуум (SALVI), чтобы позволить прямые наблюдения поверхности жидкости и жидкость-твердое взаимодействий с использованием времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрии (TOF-SIMS). 8- 11 уникальных аспектов относятся следующие: 1) окно обнаружения апертура 2-3 мкм в диаметре, допускающие непосредственное визуализации поверхности жидкости, 2) поверхностное натяжение используется для хранения жидкости внутри апертуры, и 3) SALVI является переносимыми между несколькими аналитическими платформами. 11,12
SALVI состоит из нитрида кремния (SiN) мембраны в качестве зоны детектирования и микроканале из полидиметилсилоксана (PDMS). Это РаЬгльные в чистом помещении, а также изготовления и ключ конструктивные особенности были подробно описаны в предыдущих работах и патентов. 8-12 Применения TOF-SIMS в качестве аналитического инструмента были продемонстрированы с использованием различных водных растворов и сложных жидких смесей, некоторые из который содержал наночастицы. 13-17 частности, SALVI жидкость ToF-SIMS позволяет динамическое зондирование жидкость-твердое интерфейс живых биологических системах (т.е., биопленки), одиночных клеток, и интерфейс с твердым электролитом, что открывает новые возможности для месте конденсированной фазе в исследования, включающие жидкостей с помощью TOF-SIMS. Тем не менее, текущий дизайн не позволяет газожидкостных взаимодействий пока. Это направление для будущего развития. SALVI был использован для изучения гидратированного белковой пленки в этой работе впервые.
Фибронектин является широко используемым белковый димер, состоящий из двух почти идентичных мономеров, соединенных парой дисульфидных связей, 18, которые яы хорошо известен своей способностью связывать клетки. 19,20 он был выбран в качестве модельной системы для иллюстрации того, что гидратированная белок фильм мог быть динамически исследовали с помощью SALVI жидкость TOF-SIMS подхода. Белковый раствор вводят в микроканале. После инкубации в течение 12 ч, гидратированный белок пленка формируется на задней стороне мембраны SiN. Деионизованной водой (DI) был использован, чтобы смыть канал после введения белка. Информация была собрана из гидратированных фибронектин белковых молекул в микроканале SALVI использованием динамического TOF-SIMS. DI вода также изучалась в качестве контроля для сравнения с результатами, полученными из гидратированного фибронектина тонкой пленки. наблюдались отчетливые различия между гидратной пленки белка и дистиллированной водой. Эта работа показывает, что адсорбция белка на поверхности в жидкой среде могут быть изучены с использованием нового SALVI и жидкого ToF-SIMS подход. Видео протокол предназначен для обеспечения технического руководства для тех, кто интересуетсяпри использовании этого новый аналитический инструмент для разнообразных применений SALVI с TOF-SIMS и сократить ненужные ошибки в жидкой обработки, а также сбора данных ToF-SIMS и анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI является Микрожидкостных интерфейс, который позволяет динамически поверхность жидкости и анализ раздела жидкость-твердое вещество на основе вакуумных приборов, таких как ToF-SIMS и сканирующей электронной микроскопии (SEM). Благодаря использованию малых отверстий подвергать жидкость…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
Referencias
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
