In Situ Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS
Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para o manuseamento de líquidos e a introdução da amostra a um microcanal para in situ de tempo-de-voo de iões secundários análise de espectrometria de massa de biomoléculas de proteína numa solução aquosa.
Abstract
Este trabalho demonstra a caracterização no local de biomoléculas de proteína na solução aquosa utilizando o Sistema de Análise na Interface de líquidos de vácuo (SALVI) e espectrometria de massa de íons secundários time-of-flight (TOF-SIMS). O filme proteína fibronectina foi imobilizado sobre a membrana de nitreto de silício (SIN), que forma a área de detecção Salvi. Durante a análise TOF-SIMS, três modos de análise foram realizados, incluindo alta espectrometria de massa espacial resolução, imagens bidimensionais (2D) e perfis de profundidade. Os espectros de massa foram adquiridos em ambos os modos positivos e negativos. água desionizada, também foi analisada como uma amostra de referência. Os nossos resultados mostram que a película de fibronectina em água tem picos de fragmentação água mais distintos e mais fortes em comparação com água sozinha. Picos característicos de fragmentos de aminoácidos também são observáveis na proteína hidratado TOF-SIMS espectros. Estes resultados ilustram que a molécula de proteína de adsorção sobre uma superfície pode ser estudada Dynamically usando SALVI e TOF-SIMS no meio líquido para a primeira vez.
Introduction
A hidratação é crucial para a estrutura, uma conformação, 2 e 3, a actividade biológica das proteínas. Proteínas sem as moléculas de água em torno deles não têm atividades biológicas viáveis. Especificamente, as moléculas de água interagir com a superfície interna e estrutura das proteínas, e diferentes estados de hidratação de proteínas fazer tais interacções distinta. 4 A interacção de proteínas com superfícies sólidas é um fenómeno fundamental com implicações em nanotecnologia, biomateriais e processos de engenharia de tecidos. Estudos têm indicado que a longo alterações conformacionais podem ocorrer como uma proteína encontra uma superfície. TOF-SIMS foi visualizada como a técnica que tem o potencial para estudar a interface de proteína-sólido 7/5. É importante compreender a hidratação de proteínas sobre superfícies sólidas, o que potencialmente oferece uma compreensão fundamental do mecanismo da sua estrutura, conformação e biológicaactividade al.
No entanto, as técnicas analíticas superfície principal está baseada em vácuo e aplicações diretas para estudos líquidos voláteis são difíceis devido à rápida evaporação do líquido volátil sob o ambiente de vácuo. Nós desenvolvemos um vácuo de interface microfluídico compatível, Sistema de Análise na Interface de líquidos de vácuo (SALVI), para permitir a observação direta de superfícies líquidas e interações líquido-sólido utilizando time-of-flight ion secundário espectrometria de massa (TOF-SIMS). 8- 11 os aspectos originais incluem o seguinte: 1) a janela de detecção é uma abertura de 2-3 um de diâmetro permitindo imagem directa da superfície do líquido, 2) a tensão de superfície é utilizada para conter o líquido no interior da abertura, e 3) é SALVI portáveis entre múltiplas plataformas analíticas 11,12.
SALVI é composta de uma membrana de nitreto de silício (SiN) como a área de detecção e um microcanal feito de polidimetilsiloxano (PDMS). É Fabricated na sala limpa, e os fatores de fabricação e design de chave foram detalhados em artigos e patentes anteriores. 8-12 As aplicações da TOF-SIMS como uma ferramenta analítica foram demonstrados usando uma variedade de soluções aquosas e as misturas de líquidos complexos, alguns dos que continha nanopartículas. 13-17 Especificamente, SALVI líquido TOF-SIMS permite dinâmica sondagem da interface líquido-sólido de sistemas vivos biológicos (ou seja, os biofilmes), células individuais, e interface de eletrólito sólido, abrindo novas oportunidades para a fase situ condensado estudos, incluindo líquidos usando TOF-SIMS. No entanto, o projeto atual não permite interações gás-líquido ainda. Esta é uma direção para o desenvolvimento futuro. Salvi foi usado para estudar o filme proteico hidratado neste trabalho pela primeira vez.
A fibronectina é um dímero da proteína utilizada, consiste de dois monómeros quase idênticas ligadas por um par de ligações dissulfureto, 18 que is bem conhecido por sua capacidade de ligar as células 19,20. Ele foi escolhido como um sistema modelo para ilustrar que o filme proteína hidratado poderia ser sondado dinamicamente usando o líquido SALVI TOF-SIMS abordagem. A solução de proteína foi introduzido no microcanal. Após incubação durante 12 h, uma película de proteína hidratado formado no lado de trás da membrana SiN. Deionizada (DI) de água foi usada para enxaguar o canal após a introdução de proteínas. As informações foram coletadas a partir de moléculas de proteína fibronectina hidratados no microcanal SALVI usando dinâmica TOF-SIMS. DI água também foi estudada como um controlo para comparação com os resultados obtidos a partir de película fina fibronectina hidratado. Foram observadas diferenças distintas entre o filme de proteína hidratado e água DI. Este trabalho demonstra que a adsorção de proteínas na superfície no meio líquido pode ser estudada usando o novo SALVI e abordagem TOF-SIMS líquido. O protocolo de vídeo é destinado a fornecer orientação técnica para as pessoas que estão interessadasem utilizar esta nova ferramenta analítica para diversas aplicações de SALVI com TOF-SIMS e reduzir erros desnecessários na manipulação de líquidos, bem como a aquisição de dados TOF-SIMS e análise.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI é uma interface que permite microfluídico superfície do líquido dinâmico e análise de interface líquido-sólido por instrumentos de vácuo com base, tais como TOF-SIMS e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Devido ao uso de pequenas aberturas para expor o líquido directamente no vácuo, SALVI é adequado para muitas técnicas de espectroscopia de imagiologia e finamente focados sem quaisquer modificações; 22 a portabilidade e versatilidade de microfluidos tornar-se um verdadeiro platafo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
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