Summary

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em> In Utero</em> Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

Published: January 18, 2016
doi:

Summary

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Abstract

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introduction

Dalla prima descrizione nel 2001 da tre gruppi indipendenti 1-3 i n utero elettroporazione è diventato uno strumento standard ampiamente utilizzato per analizzare l'espressione genica nel sistema nervoso centrale dei roditori. Rispetto alla generazione di topi knockout, che è, nonostante le tecniche di continuo miglioramento, ancora di tempo e denaro che consumano, i ricorsi in utero elettroporazione a causa della sua semplicità. Così, in utero elettroporazione consente GAIN- veloce ed efficiente e la perdita di funzione studi 4.

Per trasfettare le regioni cerebrali, la soluzione contenente il plasmide carica negativa viene iniettato in un ventricolo. Durante l'impulso elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il polo positivo e quindi la regione trasfettate è selezionabile semplicemente modificando la posizione del polo positivo. E 'stato spesso dimostrato che numerose regioni del sistema nervoso centrale possono essere targeted 3,5-8. Ad esempio, recenti studi dimostrano trasfezioni specifiche del ippocampo, la corteccia piriforme o striato 9-11. Tuttavia, le informazioni sulle posizioni appropriate sono spesso solo poco standardizzato e non sono sempre facili da trasferire a diversi ceppi di topi.

Trasfezione di alcune fasi embrionali è tutt'altro che banale. Molti fattori influenzano devono essere presi in considerazione quando si sceglie il set-up per specifici elettroporazione in utero. In primo luogo, per trasfettare in modo ottimale i rispettivi stadi embrionali, è necessaria la conoscenza delle tensioni del caso. Tensioni elevate riducono il tasso di sopravvivenza, mentre basse tensioni riducono l'efficienza di trasfezione 2,3,12. Anche le dimensioni del paddle dell'elettrodo gioca un ruolo fondamentale, perché l'uso di piastre di elettrodi che sono troppo grandi risultati a ridotta specificità o possono causare la morte per affetto del ritmo cardiaco 4,12,13. La applicatatensione e la dimensione e la posizione della pala dell'elettrodo sono le caratteristiche più importanti da considerare, ma ci sono anche altri fattori che influenzano il risultato della elettroporazione, come la quantità applicata di DNA-soluzione.

Abbiamo sviluppato un protocollo dettagliato che consente trasfezione veloce ed efficiente di varie regioni cerebrali del C57BL / 6 del mouse 12. In questo protocollo informazioni dettagliate sulle tensioni da utilizzare e la dimensione del paddle dell'elettrodo per una maggiore specificità è disponibile. Inoltre, informazioni riguardanti il ​​ventricolo da riempire con raccomandazioni per la quantità di soluzione plasmide e la posizione dell'elettrodo è fornito. L'indicazione delle informazioni dettagliate sulla posizione in una cartina e l'ulteriore visualizzazione di queste posizioni permette specifico semplice ed efficiente in utero elettroporazione della corteccia retrosplenial, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, tegli cornu Ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo settale laterali, il talamo e l'ipotalamo.

Protocol

Etica Dichiarazione: Il trattamento dei topi e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità agli orientamenti europei, nazionali e istituzionali per la cura degli animali. 1. In Utero Elettroporazione Nota: In utero elettroporazione è stato eseguito come precedentemente pubblicato 12,14. Pertanto, il metodo è descritto brevemente nel seguito (figura 1). Preparativi Preparare veloc…

Representative Results

La figura 2 mostra esempi di specifica in utero elettroporazione delle regioni in via di sviluppo nella corteccia retrosplenial, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, il cornu Ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo settale laterali , il talamo e l'ipotalamo. I risultati delle trasfezioni sono confrontate con l'angolazione consigliata (Figura 2). Per una migliore visualizzazione degli angoli in vivo la posizion…

Discussion

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).

Materials

EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fast Green Roth 0301.1
pCAGGS Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) Wold Precision Instrument Inc. 1B100F-4
Isoflurane (Forene) Abbott PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl) Pfizer GmbH approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) Bayer  PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution Pharmacy
of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen) Hartmann 407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture Ethicon Johnson & Johnson K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm Fine Science Tools 11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm Fine Science Tools 11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm Fine Science Tools 11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm Fine Science Tools 1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm Fine Science Tools 14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm Fine Science Tools 14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm Fine Science Tools 12565-14
Elektroporator CUY21 SC  Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Microgrinder EG-44 Narishige
P-97 Micropette Puller Sutter Instrument Company P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm Nepagene CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm Nepagene CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm Nepagene CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm Nepagene CUY650P10
Anesthesia system Rothacher-Medical GmbH CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate Rothacher-Medical GmbH HP-1M
Temperature Controller 220V AC Rothacher-Medical GmbH TCAT-2LV

Referencias

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Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J. Vis. Exp. (107), e53303, doi:10.3791/53303 (2016).

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