Summary

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Published: August 13, 2015
doi:

Summary

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Abstract

Microscopia intravitale è un metodo che può essere utilizzato per studiare processi diversi in diverse regioni e vasi negli animali viventi. In questo protocollo, si descrive la microscopia intravitale delle vene mesentere. Questo può essere eseguito in un breve periodo di tempo con risultati riproducibili mostrano interazioni leucociti-endotelio in vivo. Descriviamo un ambiente infiammatorio dopo LPS sfida dell'endotelio. Ma in questo modello si può applicare diversi tipi di patologie infiammatorie, come batteri, chimica o biologica e indagare la somministrazione di farmaci e dei loro effetti diretti sul animale vivente e il suo impatto sul reclutamento dei leucociti. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di diversi trattamenti di topi ei loro effetti sulla risposta infiammatoria nei vasi. Qui, si descrive la visualizzazione dei leucociti e piastrine etichettando fluorescente questi con rodamina 6G. Inoltre, qualsiasi immagini specifico può essere performed utilizzando mirati molecole fluorescente.

Introduction

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere una tecnica semplificata della microscopia intravitale delle vene mesentere in topi viventi per l'osservazione diretta di interazioni leucociti-endoteliale e leucociti-piastrine in condizioni infiammatorie.

Microscopia intravitale è stato sviluppato per studiare le interazioni leucociti-endotelio in vivo in condizioni infiammatorie 1,2, che non è banale, ma importante per la comprensione infiammatorio reclutamento e la funzione dei leucociti. Il metodo che descriviamo in questo protocollo è stato sviluppato sulla base di pubblicazioni precedentemente pubblicati. Simile alla visualizzazione piastrinica incorporazione in un trombo crescente 3 e parallelo a quello che è stato pubblicato in precedenza 4, un mesentere vena esteriorizzato viene esaminato al microscopio luce trasmessa. Ci sono vari altri modelli di microscopia intra-vitale, come il muscolo cremastere di ratti 5 o al fegato di topo e ratti 6.

Microscopia intravitale di mesentere vena è stata sviluppata e applicata in precedenti studi da diversi gruppi. Abbiamo usato questa tecnica per osservare le differenze nel reclutamento dei leucociti tra topi wild-type e triptofano hydroxylase1 (TPH1) – / – topi, che sono carenti di serotonina non neuronale e confrontato i risultati al topo il cui serotonina piastrinica è stata farmacologicamente impoverito da a lungo termine la domanda di un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina fluoxetina 7. Abbiamo anche esaminato le interazioni leucociti-endotelio dopo il trattamento con fluoxetina acuta 8.

In questo protocollo ci concentriamo sulla microscopia intravitale di vene mesentere, perché questo modello è possibile eseguire in modo rapido, e consente misure valide di interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti. Questo è molto più difficile e in microscopia intravitale di altri organi, come le ossa, fegato, pelle, o muscolo cremastere richiede tempo. La modal qui descritto è ideale per la valutazione riproducibile di interazione cellula-cellula infiammatoria dopo stimolante con uno stimolo infiammatorio, come l'iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla legge sulla protezione degli animali tedesca (TierSchG). I topi sono stati alloggiati e trattati in conformità alle buone pratiche di origine animale come definito da FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) e il corpo al benessere degli animali nazionale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Il comitato benessere degli animali dell'Università di Friburgo, così come le autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg) ha approvato tutti gli …

Representative Results

Una panoramica dell'impostazione sperimentale descritto in questo protocollo è mostrato in Figura 1. Essa mostra un mouse con un ileo-loop esteriorizzato e sue navi, che può essere osservata in microscopia intravitale. Figura 2 mostra certo grado di attivazione in animali non trattati a causa la procedura stessa. Ma non c'è quasi rotolamento lento o ferma adesione dei leucociti, rispetto ai topi LPS-trattati. La figura 2 mostra anche i diversi risultati della…

Discussion

Qui si descrive la preparazione e l'esecuzione di microscopia intravitale delle vene mesentere di topi in vivo. Questo metodo ci dà l'opportunità di osservare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-endotelio 11 direttamente nell'organismo vivente.

Come risposta precoce alla infiammazione dell'endotelio viene attivato e interagisce con leucociti e piastrine con conseguente rotolamento, aderenza e la trasmigrazione 12. Ma leucociti inter…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Materials

Rhodamine 6G Sigma-Aldrich  989-38-8
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 Sigma-Aldrich L2637 

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Herr, N., Mauler, M., Bode, C., Duerschmied, D. Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. (102), e53077, doi:10.3791/53077 (2015).

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