We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Intracellulaire bacteriële pathogenen kunnen repliceren in het cytosol of in gespecialiseerde pathogeen bevattende vacuolen (PCVs). Om de cytosol te bereiken, bacteriën zoals Shigella flexneri es Francisella novicida nodig om de breuk van de phagosome induceren. Daarentegen Salmonella typhimurium repliceert in een vacuolaire compartiment zogenaamde Salmonella bevattende vacuole (SCV). Maar bepaalde mutanten van Salmonella niet aan SCV integriteit te behouden en zijn dus vrij in het cytosol. Het percentage cytosolische vs. vacuole bacteriën op het niveau van afzonderlijke bacteriën kan worden gemeten door differentiële permeabilisatie, ook bekend als phagosome bescherming assay. De aanpak maakt gebruik van het onroerend goed van wasmiddel digitonine selectief cholesterol te binden. Aangezien de plasmamembraan bevat meer cholesterol dan andere cellulaire membranen kunnen digitonine worden gebruikt om selectief permeabiliseren het plasmamembraan terwijl intracellulaire membranenintact. Kortom, na infectie met het pathogeen expressie brengen van een fluorescente merker eiwit (bijv mCherry oa), wordt het plasmamembraan gastheercellen permeabel gemaakt met een korte incubatie in digitonine bevattende buffer. De cellen worden vervolgens gewassen en geïncubeerd met primair antilichaam (gekoppeld aan een fluorofoor keuze) gericht tegen de bacterie naar keuze (bijvoorbeeld anti- Salmonella FITC) en opnieuw gewassen. Als alleen bacteriën worden gebruikt, kan een extra stap worden uitgevoerd, waarbij alle membranen permeabel en bacteriën gekleurd met een corresponderende antilichaam. Na de kleuring, kan het percentage in vacuolen en cytosolische bacteriën worden gekwantificeerd door FACS of microscopie door telling met één of twee positieve gebeurtenissen. Hier hebben we experimentele details voor het gebruik van deze techniek met de bacterie Salmonella typhimurium. Het voordeel van deze test is dat, in tegenstelling tot andere assay biedt een kwantificering van het niveau van afzonderlijke bacte-ria, en indien geanalyseerd met behulp van microscopie levert het exacte aantal cytosolische en vacuolaire bacteriën in een bepaalde cel.
Intracellulaire bacteriële pathogenen repliceren rechtstreeks in de gastheercel cytosol of in gespecialiseerde vacuolaire compartimenten 1. Tijdens de beginfase van de infectie meest pathogenen te geïnternaliseerd hetzij fagocytose door gespecialiseerde cellen (bijvoorbeeld macrofagen) of actief bevorderen hun opname in niet-fagocytaire cellen. In fagocytische cellen, de fagosoom normaal gen met lysosomen een degradatieve compartiment, waarbij de gefagocyteerde deeltjes gedigereerd vormen. Gespecialiseerde cytosolische bacteriën, zoals Francisella novicida of Shigella flexneri, ontsnappen phagosomal afbraak door het induceren van de breuk van de phagosome en vervolgens ontsnappen in de cytosol 2,3. Dit vereist-virulentie geassocieerd mechanisme zoals de Francisella Pathogeniteit Island (FPI), of de Shigella flexneri T3SS, die effector eiwitten die de vacuole breuk 2-4 bevorderen injecteert. De gastheercel cytosol functieseen aantal geconserveerde patroonherkenning receptoren die normaal gesproken de aanwezigheid van ziekteverwekkers herkennen en veroorzaken aangeboren immuunsysteem signalering 5. Bovendien xenophagy, een antimicrobieel vorm van autophagy kan bacteriën die de cytosol voeren degraderen. Cytosolische bacteriën zijn doorgaans goed aangepast aan het bot of te omzeilen deze reacties met behulp van verschillende strategieën. Bijvoorbeeld, Francisella wijzigt haar LPS gastheer erkenning te vermijden en Shigella voorkomt autofagie recruitment met uitgescheiden effector eiwitten 6,7.
Een andere strategie om lysosomale degradatie ontsnappen is in dienst van het model vacuole pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium, daarna aangeduid als Salmonella typhimurium. Salmonella maakt gebruik van een T3SS aan effectoren dat de eerste phagosome verbouwen in zijn intracellulaire niche te injecteren, de Salmonella bevattende vacuole (SCV) 8,9. Continue manipulatie van gastheer paden ismoet deze vacuole door het aantrekken lipiden en andere voedingsstoffen naar de vacuole te handhaven. Inderdaad, een Sifa mutant van Salmonella nalaat vacuolaire stabiliteit, en komt in de cytosol gastheercellen binnen enkele uren na infectie, wat resulteert in activering van innate immune paden en autophagy recruitment 8. Vacuolaire ontsnappen van Salmonella varieert afhankelijk van het celtype dat studies en verschillende rapporten hebben aangetoond dat epitheelcellen zelfs WT Salmonella kunnen de SCV en hyperreplicate ontsnappen in de cytosol 10. Recente rapporten tonen aan dat aangeboren immuunsysteem detectie vacuolen pathogenen ook afhankelijk van het vermogen van de gastheer herkennen en destabiliseren pathogeen bevattende vacuolen (PCVs) 11-14.
Aangezien de host of de bacteriën kunnen genotype verdeling van intracellulaire bacteriën tussen de vacuole en cytosolische compartiment beïnvloeden, is het noodzakelijk om het aantal vacuolen vs. kwantificerencytosolische bacteriën. Aangezien in de meeste experimentele opstellingen gastheercellen worden geïnfecteerd met meer dan één bacterie, vervolgens kunnen verschillende bacteriën herbergen in verschillende subcellulaire compartimenten, is een techniek vereist die kwantificering mogelijk maakt op het niveau van afzonderlijke bacteriën. Differential permeabilisatie (ook bekend als bescherming phagosomal test) biedt deze resolutie 2,4,10,12. De assay is gebaseerd op selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan gastheercel met het detergens digitonine, die vacuolaire membranen wordt afgebroken en maakt daardoor selectieve kleuring van cytosolisch bacteriën antilichamen. Hier hebben we twee protocollen voor het kwantificeren van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium middels differentiële permeabilisatie. Het principe van deze werkwijze wordt beschreven in Figuur 1: beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) worden geïnfecteerd met stationaire fase mCherry-expressie Salmonella. Stationaire fase Salmonella nodig to worden gebruikt omdat ze downregulate de uitdrukking van de SPI-1 T3SS, waarvan de activiteit anders zouden worden erkend door de NLRC4 inflammasoom en veroorzaken een snelle celdood (pyroptosis) van de BMDMs 15. Na de infectie werden de cellen worden gewassen en behandeld met 50 ug / ml digitonine gedurende 1 minuut. Cellen worden onmiddellijk opnieuw gewassen en geïncubeerd met anti-Salmonella-antilichamen gekoppeld met FITC bacteriën markeren met toegang tot het cytosol. Na een additionele wasstap cellen worden gelyseerd en het percentage mCherry + (vacuole) en FITC + / + mCherry (cytosol) bacteriën wordt bepaald door FACS. We rapporteren ook een aanpassing van deze werkwijze die kan worden gebruikt als er geen fluorescerend eiwit tot expressie stammen zijn (figuur 2). Extra stappen zijn ingevoerd na de FITC labeling waarbij cellen gefixeerd en volledig gepermeabiliseerd. Daarna alle bacteriën worden gekleurd met anti-Salmonella antistoffen en bijbehorende secundaire antilichamen. Deteel gebeurt dan door middel van microscopisch plaats van FACS-analyse.
Differential permeabilisatie is een eenvoudige en robuuste methode te analyseren en kwantificeren van de subcellulaire verdeling van de bacteriële ziekteverwekkers tussen vacuole compartimenten en het cytosol. Dezelfde test is met succes gebruikt bij bacteriën zoals Francisella novicida 2,4 es Shigella flexneri 12. Aangezien vele intracellulaire pathogenen wijzigen of de ontvangende structuren endomembrane wijzigen, de robuustheid van de digitonine permeabilisatie zal moeten wor…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Mathias S. Dick, Roland F. Dreier en Sebastian Rühl erkennen voor discussie. Dit werk werd ondersteund door een SNSF lectoraat PP00P3_139120 / 1 en een universiteit van Basel projectsubsidie ID2153162 naar PB
Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
PFA | mpbio | 219998380 | |
HEPES | Life Technologies | 15630 | |
Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
Saponin | Sigma | 47036 | |
Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
Glycine | Sigma | G8898 | |
Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
PBS | Gibco | 20012-019 | |
DMEM | Sigma | D6429 | |
NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |