胞浆的定量与液泡<em>沙门氏菌</em>在原发性巨噬细胞差透

细胞内细菌病原体复制或者直接在宿主细胞胞质溶胶，或者在专门的液泡区室^1。在感染的初始阶段大多数病原体获得通过吞噬​​作用由专门的细胞（如巨噬细胞），或通过积极推动自身摄取进入非吞噬细胞内化两种。在吞噬细胞，吞噬体通常与溶酶体融合，以形成降解隔室，其中所述吞噬颗粒被消化。专门胞浆菌，如弗朗西斯novicida或志贺氏菌 ，逃避吞噬体降解通过诱导吞噬体的破裂和随后逃逸进入细胞质^2,3。这需要毒力相关的机制，如弗朗西斯致病岛（FPI）或痢疾杆菌 T3SS，其中注入效应蛋白促进液泡破裂^2-4。宿主细胞细胞质的功能一些保守模式识别受体，通常承认的病原体的存在和诱导先 ​​天免疫信号^5。此外，xenophagy，自噬的抗微生物形式能降解该进入细胞质细菌。胞浆菌通常很好地适应生硬或采用不同的策略规避这些反应。例如， 弗朗西斯修改其LPS以避免主机识别和志贺防止自噬招聘使用分泌效应蛋白^6,7。

另一种策略逃脱溶酶体降解由模型液泡病原体沙门伤寒采用，此后简称为鼠伤寒沙门氏菌 。 沙门氏菌使用T3SS注入该重塑的初始吞噬体进入细胞内利基效应， 沙门氏菌含液泡（SCV） ^8,9。连续操纵宿主的途径是要保持这种空泡招募脂类等营养物质到液泡。事实上， 沙门氏菌的SIFA突变体不能维持液泡稳定，并进入宿主细胞后数小时内细胞质感染后，这导致活化先天免疫途径和自噬招募^8。 沙门氏菌的液泡逃逸取决于细胞类型即研究，一些报告显示，在上皮细胞中甚至WT 沙门氏菌能逃脱SCV和hyperreplicate在细胞质^10。最近的报告表明，先天免疫检测的病原体空泡也取决于主机的认可和破坏含病原体的空泡^{（PCVs）11-14}能力。

鉴于这两个主机或细菌基因型可影响空泡和细胞内室之间的胞内细菌的分布，有必要进行量化空泡对的数目胞浆菌。因为，在大多数实验设置宿主细胞感染有一个以上的细菌，并随后可以在不同的亚细胞区室怀有几个细菌，一种技术是必要的，它允许量化在单细菌的水平。通透性差（也称为吞噬体保护法）提供了这一决议^2,4,10,12。该测定法是基于宿主细胞质膜与洗涤剂毛地黄皂苷，这让液泡膜完好的选择性透和因此允许胞浆菌的抗体的选择性染色。在这里，我们提供了两种协议的使用差分通透性胞浆空泡和鼠伤寒沙门氏菌的定量。这个方法的原理在图1中被描述：骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）感染固定相mCherry表达沙门氏菌 。固定相沙门氏菌需要牛逼ø被使用，因为它们下调的SPI-1 T3SS，其活性将另外由NLRC4炎性被识别，诱导BMDMs ¹⁵的快速细胞死亡（pyroptosis）的表达。以下洗涤细胞并用毛地黄皂苷50μg/ ml的1分钟处理过的感染。将细胞立即再次洗涤和温育与耦合到FITC与访问到细胞质标记细菌的抗沙门氏菌抗体。后的附加洗涤步骤细胞裂解和mCherry +（液泡）和FITC + / mCherry +（细胞质）的细菌的百分比是通过FACS测定。我们还报告这种方法，可用于在没有荧光蛋白表达菌株是可用的（ 图2）的适应。附加步骤的FITC标记，其中将细胞固定并完全透后进行了介绍。此后所有的细菌都沾满抗沙门氏菌抗体和相应的二次抗体。 DET挠度然后通过显微镜代替FACS分析进行。