3D Organotypic Co-kultur Modell Stöd Medullary Thymic epitelcellproliferation, differentiering och promiskuös Gene Expression
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
Intra-tymisk T-cell utveckling kräver en invecklad tredimensionellt nätverket består av olika stromaceller, det vill säga icke-T-celler. Tymocyter passera denna byggnadsställning på ett mycket samordnat tid och rum ordning medan sekventiellt passerar obligatoriska kontrollpunkter, det vill säga, T-cells härstamning engagemang, följt av T-cellsreceptor repertoar generation och val före exporten i periferin. De två stora bosatt celltyper som utgör denna ställningen är kortikala (cTECs) och medullär tymiska epitelceller (mTECs). Ett viktigt inslag i mTECs är den så kallade promiskuösa uttryck av många vävnadsbegränsade antigener. Dessa vävnadsbegränsade antigener presenteras för omogna tymocyter direkt eller indirekt av mTECs eller tymiska dendritiska celler, respektive resulterar i självtolerans.
Lämpliga in vitro-modeller emulerar utvecklingsvägar och funktioner cTECs och mTECs finns för närvarande lackung. Denna brist på lämpliga experimentella modeller har till exempel svårare att analysera promiskuösa genuttryck, som fortfarande är dåligt känd på cellulär och molekylär nivå. Vi anpassade en 3D organotypic co-kultur-modellen till kultur ex vivo isolerade mTECs. Denna modell var ursprungligen tänkt att odla keratinocyter på ett sådant sätt för att generera en hudekvivalent in vitro. 3D-modellen bevaras viktiga funktionella egenskaper hos MTEC biologi: (i) spridning och terminal differentiering av CD80 lo, Aire-negativ till CD80 hej, Aire-positiva mTECs, (ii) mottaglighet för RANKL, och (iii) ihållande uttryck av FoxN1, Aire och vävnads begränsade gener i CD80 hi mTECs.
Introduction
Utvecklings tymocyter utgör omkring 98% av tymus, medan de återstående 2% består av en mängd celler som kollektivt komponera tymisk stroma (dvs., epitelceller, dendritiska celler, makrofager, B-celler, fibroblaster, endotelceller). De yttre kortikala epitelceller (cTECs) procure invandringen av pro-T-celler från benmärgen, T-cell lineage induktion hos multi pre-T-celler och positiv selektion av själv-MHC-begränsad omogna tymocyter. De inre medullär tymiska epitelceller (mTECs) är inblandade i toleransinduktion av dessa tymocyter med en hög affinitet TCR för själv-peptid / MHC-komplex genom att antingen inducera negativ selektion eller deras avvikelse i T reglerande cellhärkomst. I samband med centrala toleransinduktion, mTECs är unika genom att de uttrycker ett brett spektrum av vävnads begränsad självantigener (Trás) vilket speglar den perifera själv. Detta fenomen kallas promiskuöst genuttryck (PGE)1,2.
De flesta av dagens studier på denna fascinerande celltyp lita på ex vivo isolerade celler, som olika korttids 2D odlingssystem alltid resulterat i förlust av PGE och nyckelregulator molekyler som MHC klass II, FoxN1 och Aire inom de första 2 dagar 3-6 . Det förblev dock oklart, vilka särskilda komponenter och funktioner i den intakta 3D nätverket av tymus saknades i 2D-modeller. Åter aggregering tymisk organkultur (RTOC) har varit hittills den enda 3D-system som gör det möjligt att studera T-cell utveckling, å ena sidan, och stromal cellbiologi, å andra sidan, i en intakt tymus mikro 7. Ändå RTOCs har vissa begränsningar, dvs de redan innehåller en komplex blandning av celler, kräver inmatning av fetala stromaceller och uthärda en maximal odlingsperiod på 5 till 10 dagar.
Bristen på reduktionistisk i odlings vitro-system har försvårat studiet avflera aspekter av T-cellutveckling och tymus organogenesen inte minst molekylär reglering av PGE och dess relation till utvecklingsbiologi av mTECs.
På grund av nära släktskap med strukturerad organisation av epitelceller i huden och bräss, valde vi en 3D organotypic kultur (OTC) system som hade utvecklats ursprungligen för att efterlikna differentieringen av keratinocyter in vitro och därmed skapa en dermal ekvivalent. OTC-systemet består av en inert ställningsmatris som överdras med dermala fibroblaster som är fångade i en fibringel, på vilket keratinocyter ympas 8,9. Här ersatte vi keratinocyter med renade mTECs. Medan hålla de grundläggande funktionerna i den här modellen, vi optimerat vissa parametrar.
I den antagna OTC-modellen mTECs frodats, genomgick terminal differentiering och underhållas MTEC identitet och PGE, alltså nära härma in vivo mTECs utveckling <sup> 10. Denna tekniska anmärkning ger ett detaljerat protokoll tillåter stegvis installation av bräss OTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vid sidan av RTOCs har 3D OTCs varit överlägset överlägsen när det gäller TEC differentiering och PGE underhåll / induktion (tabell 1) jämfört med andra (i) förenklade 3D kulturer "med – fibroblaster ensam utan ställningen; (Ii) 2D system som använder – fibroblaster / matarceller samodlade med TEC 10, (iii) 3T3-J2 celler vari TEC kloner utvecklas, men PGE förloras, (iv) matrigel eller (v) ECM-komponenter (opublicerade data). PGE kvarstod i upp till 7 dagar i 3D OTCs, 4…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
Referencias
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
