수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
인트라 흉선 T 세포의 발달은 각종 간질 세포, 즉, 비 – T 세포로 구성된 복잡한 삼차원 메쉬 작업을 필요로한다. 순차적으로 즉, T 세포 수용체 레퍼토리 생성 및 선택에 따라 T 세포 계보 헌신 전에 주변에 자신의 수출에 필수 체크 포인트를 통과하면서 흉선 세포는 매우 조정 공간적 위해이 발판을 통과. 이 골격을 형성하는 두 가지 주요 상주 세포 유형은 (cTECs) 피질과 수질 흉선 상피 세포 (mTECs에게)입니다. mTECs의 주요 기능은 수많은 조직 제한 항원의 소위 무차별 표현이다. 이 조직 제한 항원은 각각 자기 허용 오차의 결과로, mTECs 또는 흉선 수지상 세포에 의해 직접 또는 간접적으로 흉선 세포를 미숙하기 위해 제공됩니다.
cTECs과 mTECs의 발달 경로와 기능을 모방 시험관에 적합한 모델은 현재 락입니다왕. 적절한 실험 모델의 부족은 예를 들면 아직 저조한 세포 및 분자 수준의 이해 난잡한 유전자 발현의 분석을 방해했다. 우리는 생체 고립 mTECs 문화 차원의 Organotypic 공동 문화 모델을 적용. 이 모델은 원래 생체 외 피부 동등 물을 생성하는 방식으로 케 라티노 사이트를 배양하기 위해 고안되었다. , CD80 안녕, 에르 양성 mTECs, RANKL에 (II) 응답 및 FoxN1의 (III) 지속 식으로 (I)의 증식과 CD80 보라, 에르 음성 단자 차별화 : 3D 모델은 mTEC 생물학의 주요 기능 기능을 보존 에르와 CD80 안녕 mTECs에서 조직 제한 유전자.
Introduction
나머지 2 %는 공동으로 흉선 기질을 구성하는 다양한 세포로 구성되어있는 동안 개발 흉선 세포는 흉선의 약 98 %를 차지 (즉, 상피 세포, 수지상 세포, 대 식세포, B 세포, 섬유 아세포, 내피 세포). 외부 대뇌 피질 상피 세포 (cTECs)는 다 능성 사전 T 세포 및 자기 MHC의 긍정적 인 선택의 골수, T 세포 계보 유도에서 프로 T 세포의 이민을 조달 미성숙 흉선 세포를 제한했다. 내부 수질 흉선 상피 세포 (mTECs)을 유도 부정적인 선택 또는 T 조절 세포 계보에 자신의 편차 중 하나에 의해 자기 펩타이드 / MHC 복합체에 대한 높은 선호도 TCR과 그 흉선 세포의 내성 유도에 참여하고 있습니다. 중앙 관용 유도의 맥락에서, mTECs은 따라서 주변 자체 미러링 조직 제한자가 항원 (TRAS)의 다양한 스펙트럼을 표현하는 점에서 독특합니다. 이 현상은 무차별 유전자 발현이라고 (PGE)1,2.
다양한 단기 2D 문화 시스템은 변함없이 처음 이일 3-6 내에서 MHC 클래스 II, FoxN1과 에르 같은 PGE의 손실과 키 조절 분자의 결과로이 매혹적인 세포 유형에 현재 대부분의 연구는 생체 분리 된 세포에 의존 . 그것은 특정 구성 요소와 흉선의 그대로 3 차원 그물 세공의 기능은 2D 모델에서 누락 된, 그러나 불분명 남아 있었다. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 그대로 흉선 미세 7에서 원경 한편 만 3D 한편, T 세포 발달의 연구를 허용 시스템, 및 간질 세포 생물학,이었다. 그러나 RTOCs들은 이미 태아 간질 세포의 입력을 필요로 5-10 일 최대 배양 기간을 견딜 세포 복합체를 포함하는, 즉, 특정 제한을 갖는다.
체외 배양 시스템의 환원의 부족의 연구를 방해하고있다T 세포 개발 및 흉선 기관 형성의 여러 측면하지 적어도 분자 PGE의 규제와 mTECs의 발달 생물학의 관계.
피부와 흉선의 상피 세포의 구조 조직의 확대 연관성으로 인해, 우리는 체외에서 각질 세포의 분화를 에뮬레이트함으로써 피부 동등한를 만들 원래 개발되었던 3D의 Organotypic 문화 (OTC) 시스템을 선택했다. OTC 시스템은 각질 세포가 8,9를 접종하는에 섬유소 젤에 갇혀있다 진피 섬유 아세포와 겹쳐 불활성 지지체 매트릭스로 구성되어 있습니다. 여기, 우리는 정제 mTECs와 각질 세포를 대체했다. 이 모델의 기본 기능을 유지하면서, 우리는 특정 매개 변수를 최적화.
mTECs가 증식 채택 장외 모델에 따라서 밀접하게 생체 mTECs 개발 모방, 단말 차별화를 시행하고 mTEC ID 및 PGE을 유지 <sup> 10. 이 기술 노트는 흉선 OTCs의 단계적 설정을 허용하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RTOCs 외에도, 3D OTCs는 TEC 차별화와 PGE 유지 보수 / 유도 다른 (I)에 비해 (표 1) '단순화 된 3D 문화'는 사용의 측면에서 훨씬 우수하여왔다 – 섬유 아세포를 혼자 발판없이; (II) 2D 시스템을 사용하여 -, (ⅲ) 3T3-J2 세포 TEC 클론 개발에있어서, 열팽창 계수의 차이 (10)와 공동 배양 된 섬유 아세포 / 피더 세포,하지만 PGE가 손실 (IV) 마트 리겔 또는 (V) ECM 구성 요소 (게시되지 않은 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
Referencias
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