3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
Desenvolvimento de células T intra-timo requer uma malha tridimensional complexa composta por várias células do estroma, ou seja, células não-T. Timócitos atravessar este andaime em uma ordem temporal e espacial altamente coordenada enquanto sequencialmente passar pontos de verificação obrigatórios, ou seja, T compromisso linhagem de células, seguido de geração repertório receptor de células T e seleção antes da sua exportação para a periferia. Os dois tipos de células residentes principais que formam este andaime são células epiteliais do timo corticais (CTECs) e medular (células mTEC). Uma característica chave de células mTEC é o chamado promíscuo expressão de numerosos antigénios restrita a um tecido. Estes antigénios restrita a um tecido são apresentados para os timócitos imaturos, directa ou indirectamente por células mTEC ou células dendríticas do timo, respectivamente, resultando em auto-tolerância.
Adequados in vitro modelos emulando as vias de desenvolvimento e as funções de CTECs e células mTEC Atualmente lacrei. Esta falta de modelos experimentais adequados, por exemplo, tem dificultado a análise da expressão do gene promíscuo, que ainda está mal compreendida no nível celular e molecular. Nós adaptamos um modelo de co-cultura 3D organotípico à cultura ex vivo células mTEC isoladas. Este modelo foi inicialmente criado para cultivar queratinócitos, de modo a gerar um equivalente de pele in vitro. O modelo 3D preservou as características funcionais do MTEC biologia: (i) a proliferação e diferenciação terminal de CD80 lo, Aire-negativo em CD80 oi, Aire-positivo células mTEC, (ii) capacidade de resposta a RANKL, e (iii) a expressão sustentada de Foxn1, Aire e genes restrita de tecidos em células mTEC CD80 hi.
Introduction
Timócitos desenvolvimento perfazem cerca de 98% do timo, enquanto que os restantes 2% é composto por uma variedade de células que compõem colectivamente o estroma tímico (isto é, células epiteliais, células dendríticas, macrófagos, células B, f ibroblastos, células endoteliais). As células epiteliais cortical exterior (CTECs) adquirir imigração de células pro-T a partir de medula óssea, t indução linhagem celular em células pré-T multipotentes e selecção positivo de auto-MHC restrita timócitos imaturos. As células interiores medulares do timo epiteliais (células mTEC) estão envolvidas na indução de tolerância desses timócitos com um TCR de elevada afinidade para complexos de auto-péptido / CPH por indução ou selecção negativa ou seu desvio para a linhagem de células T reguladora. No contexto da indução de tolerância central, células mTEC são únicos na medida em que expressam uma ampla gama de auto-antigénios restrita a um tecido (TRAs) espelhamento assim a auto periférica. Este fenômeno é chamado de expressão gênica promíscua (PGE)1,2.
A maioria dos estudos actuais sobre este tipo de célula fascinante dependem ex vivo células isoladas, como vários sistemas de cultura de curto prazo 2D invariavelmente resultou na perda de moléculas de PGE e como regulador chave do MHC de classe II, e Foxn1 Aire dentro dos primeiros 2 dias 06/03 . Ele permaneceu no entanto claro, que determinados componentes e características da malha 3D intacta do timo estavam faltando em modelos 2D. A cultura de órgão tímico re-agregação (RTOC) tem sido até agora o único sistema 3D, que permite o estudo do desenvolvimento de células T, por um lado, e da biologia celular de estroma, por outro lado, em um micro-ambiente do timo 7 intacto. No entanto, RTOCs tem certas limitações, isto é, que já contêm uma mistura complexa de células, requerem a utilização de células estromais fetais e suportar um período de cultura máxima de 5 a 10 dias.
A falta de redutora em sistemas de cultura in vitro tem dificultado o estudo dovários aspectos do desenvolvimento de células T do timo e organogênese não menos importante a regulação molecular da PGE e sua relação com a biologia do desenvolvimento de células mTEC.
Devido à estreita-relação da organização estruturada das células epiteliais da pele e do timo, optamos por um sistema 3D cultura organotípicas (OTC), que tinha sido desenvolvido originalmente para emular a diferenciação de queratinócitos in vitro e, assim, criar um equivalente dérmico. O sistema OTC consiste em uma matriz de andaime inerte coberto com fibroblastos dérmicos que estão presos em um gel de fibrina, na qual os queratinócitos são semeados 8,9. Aqui, nós substituímos queratinócitos com células mTEC purificados. Mantendo as características básicas deste modelo, nós otimizamos determinados parâmetros.
No modelo adotado OTC células mTEC proliferaram, foram submetidos a diferenciação terminal e mantido identidade MTEC e PGE, assim estreitamente imitando in vivo células mTEC desenvolvimento <sup> 10. Esta nota técnica proporciona um protocolo detalhado permitindo que o passo a passo set-up de OTCs timo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao lado RTOCs, o OTCs 3D têm sido, de longe, superior em termos de diferenciação do TCE e PGE manutenção / indução (Tabela 1) em comparação com outros (i) 'culturas 3D simplificadas' usando – fibroblastos sozinho, sem o cadafalso; (Ii) sistemas 2D utilizando – células fibroblastos / alimentador de co-cultivadas com TEC 10, (iii) células 3T3-J2 em que os clones TEC desenvolver, mas é perdida PGE, (iv) Matrigel ou (v) de componentes da matriz extracelular (dados não publica…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
Referencias
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