3D organotypiske Co-kultur Modell Støtte Medullary Thymus- epitelcelleproliferasjon, Differensiering og Promiscuous Gene Expression

Utviklings thymocytter utgjør omtrent 98% av thymus, mens de resterende 2% består av en rekke celler som kollektivt komponere thymisk stroma (dvs. epitelceller, dendrittiske celler, makrofager, B-celler, fibroblaster, endotelceller). De ytre kortikale epitelceller (cTECs) anskaffe innvandring av pro-T-celler fra benmargen, T-celle avstamning induksjon i multipotente pre-T-celler og positiv utvelgelse av selv MHC begrenset umodne thymocyttene. De indre medullære tymiske epitel-celler (mTECs) er involvert i induksjon av toleranse disse thymocyttene med en høy affinitet for TCR selv-peptid / MHC-komplekser ved enten å indusere negativ seleksjon eller deres avvik i T-celle regulatoriske avstamning. I forbindelse med sentraltoleranseinduksjon, mTECs er unike ved at de uttrykker et bredt spekter av vev-begrenset selvantigener (tras) således speiler den perifere selv. Dette fenomenet kalles promiskuøse genuttrykk (PGE)^1,2.

De fleste aktuelle studier på denne fascinerende celletype er avhengige av ex vivo isolerte celler, som ulike kortsiktige 2D kultursystemer alltid resulterte i tap av PGE og nøkkel regulator molekyler som MHC klasse II, FoxN1 og Aire løpet av de første to dagene ^3-6 . Det forble imidlertid uklart, hvilke spesielle komponenter og funksjoner intakt 3D meshwork av thymus manglet i 2D-modeller. Den re-aggregering tymisk organkultur (RTOC) har vært så langt det eneste 3D-system som tillater studiet av T-celle utviklingen, på den ene side, og stromal cellebiologi, på den annen side, i et intakt thymus mikromiljø ^7. Likevel, RTOCs har visse begrensninger, det vil si, at de allerede inneholder en kompleks blanding av celler, innebærer bruk av føtale stromale celler og tåle en maksimal dyrkningsperiode på 5 til 10 dager.

Mangelen på reductionist in vitro kultursystemer har hemmet studiet avflere aspekter av T-celle utvikling og thymic organogenesen ikke minst den molekylære regulering av PGE og dets forhold til utviklingsbiologi hos mTECs.

På grunn av den nære relatert av strukturert organisering av epitelceller i huden og thymus, vi har valgt en 3D organotypic kultur (OTC) system som hadde blitt opprinnelig utviklet for å etterligne differensiering av keratinocytter in vitro og dermed skape en dermal tilsvarende. OTC-systemet består av en inert matriks stillas belagt med dermale fibroblaster som er fanget i en fibringel, hvorpå keratinocytter utsåes ^8,9. Her, erstattet vi keratinocytter med rensede mTECs. Samtidig som de grunnleggende funksjonene i denne modellen, vi optimalisert visse parametre.

I vedtatt OTC modell mTECs proliferated, gikk terminal differensiering og vedlikeholdes Mtec identitet og PGE, og dermed tett etterligne in vivo mTECs utvikling <sup> 10. Denne tekniske notatet gir en detaljert protokoll slik at den trinnvise oppsett av thymus OTC.