Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
סרטן השחלות הוא הגידול ממאיר גינקולוגיות הקטלנית ביותר בארצות הברית עם הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה להיות תכונות של מחלה זו חוזרות ונשנות מאוד, chemoresistant. טיפול ראשוני מורכב לרוב מניתוח cytoreductive מקסימאלי וטיפול פלטינה לאחר מכן מבוסס, אם כי יש כמה עדויות לכך טיפול neoadjuvant עשוי להיות מועיל במקרים מסוימים 1. רוב המטופלים מגיבים בחיוב לטיפול ראשוני, אך למרבה הצער המחצית תהיה להרע בתוך 18 חודשים 2.
רוב גידולים ממאירים בשחלות הם קרצינומה אפיתל ויכולים לנבוע epithelia של 3,4 צינור השחלה או השחלה לפני השטח. מספר מחקרים תומכים בקיומם של תאי גזע סומטיים במערכת הרבייה הנשית שככל הנראה לסייע בתיקון רקמות שצריך בעקבות ביוץ 5,6. פעילות שגשוג הגבוהה בשתי השחלות וחצוצרות במהלך ovulation עשוי להיות גורם חשוב בהתפתחות של סרטן השחלות (Gharwan, et al. כתב יד שהוגש). הגזירה של תאי יוצרי גידול לא ברורה אבל הם יכולים לנבוע מתאי נורמלים גזע, תאי אב, או תאים מובחנים באמצעות מוטציות ההופכות אותם לא הצליח להסדיר החלוקה או גורל. תאים אלה יש גם מכונים "תאי גזע סרטני," או "תאי סרטן-ייזום," ויכולים לגדול לתוך spheroids tumorigenic, רב-תאי בתנאי התקשרות נמוכים. למרות שהמודל ההיררכי של פיתוח TIC עשוי להיות דינמי, טיקים חולקים רבים של אותן התכונות כמו תאי גזע נורמלים כוללים quiescence, התנגדות לכימותרפיה, התחדשות עצמית לטווח ארוך ויכולת להתמיין שושלות תאים שונות 7,8.
מספר מחקרים תומכים בקיומה של טיקים בסרטן השחלות ומאמצים הנוכחיים נמצאים בעיצומם כדי להבהיר את המנגנון (ים) שבו תאים אלה תומכים ביצירת גידולים 9-11. כמה סמנים הוצעו לזהות טיקים השחלות עם tumorigenicity המשופר כולל CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, וMyD88, למרות שתרומתו של כל סמן המדויק אינה ברורה ויכולה להיות סוג התא ספציפי 11-16. בעוד סמן אוניברסלי או קבוצה של סמנים לא הוקם באופן חד משמעי לטיקי השחלות, קבוצות שונות הצליחו לבודד טיקים השחלות נפוצות יותר על ידי בחירה עבור CD44 +, CD133 + ו / או תאים עם dehydrogenase אלדהיד פעילות הגבוה (ALDH) 13,17-21. CD44 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני הפועל כקולטן לחומצה היאלורונית ומסדיר כמה תהליכים חשובים להתקדמות גידול, כוללים הדבקה, התפשטות, הגירה, אנגיוגנזה ובידול 22. CD133 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני שתפקידה עדיין לא ברור, אך מחקרים מראים שזה מארגן טופולוגיה קרום פלזמה 23. ALDH, אנזים תאיים שמזרז את החמצון של אלדהידים, עשוי להיות רוב היקוםסמן אל של טיקים כפעילות גבוהה זוהה בתאי גזע שבודדו ממגוון רחב של רקמות ותפקידים מרובים יוחסו לALDH בתמיכת תאי גזע נורמלים ו -24 טיקים. נכון לעכשיו, נראים CD133 וALDH1 להיות הסמנים לשחזור ביותר של טיקים השחלות 13,21.
בנוסף להבנת המאפיינים של טיקים, יש גם מאמץ גדול כדי לזהות תרופות שמתמקדות תת-אוכלוסייה זו. שיעור ההישנות הגבוה הקשורים לסרטן השחלות יכול להיות בגלל הכישלון של טיפולי הכימותרפיה הנוכחיות למיגור הצלחת טיקים. למרות שחלק הארי של הגידול הוא רגיש לטיפולים קיימים, טיקים נחשבים לעמיד ובצפיפות בלתי ניתנת לגילוי על ידי שיטות סטנדרטית. מנגנוני הבהרה של התנגדות טיפול והישנות של גידול הם חיוניים כדי לשפר את התגובה ושיעורי הישרדות כוללת של חולים עם סרטן שחלות.
כאן, טכניקות תרבות מתוארות הבלהעשיר לטיקים משורות תאי סרטן השחלות הוקמו ועיקריות. תנאי התרבות מתוארים כאן נעשו שימוש על ידי מספר קבוצות כדי לגרום להתפשטות של טיקים או תאי אליפטית עם איכויות תאי גזע 11,12,14,16,20. למרות שיש כמה במדיות תרבות תאי גזע ותוספים נפוצים להעשרת טיקים / spheroids השתמשנו נוסחת סרום ללא מדיה עם EGF וFGF, אך ללא תוספת של B27 או N-2 תוספים. תוספי מזון אלו, המשמשים בדרך כלל לתרבית תאים עצבית ומעשיר לתאי גזע, הוכחו לקדם פנוטיפ mesenchymal 25,26 ונותר אי ודאות בתחום, האם טיקים שיש mesenchymal או הפנוטיפ אפיתל הם tumorigenic יותר 27-29 . כדי למזער את חוסר ודאות ומשתנים אנו שבחרנו להשתמש בנוסחה הנפוצה ביותר, עם תאי סרטן השחלות אפיתל מאז אנו עוסקים.
שמירה על תאים בסרום ללא מדיה בבקבוק מצורף נמוךמאפשר היווצרות אליפטית ותומך בהתפשטות של תאים עם ביטוי CD133 ופעילות ALDH גבוהה. העבודה שלנו הראתה עוד, כי תאים צפים בתנאים חסיד נורמלים גם יכולים לייצג אוכלוסיית TIC tumorigenic יותר. הזרקה של תאים שגודלו בתנאים אלו לעכברים בעירום athymic מובילה לפוטנציאל גבוה יותר בהשוואה לתאים סרטני גדלו בתנאים מצורפים בנוכחות הסרום. מידע רב בנוגע לתפקידו של טיקים בייזום סרטן השחלות, התקדמות, תגובה לטיפול, והישנות מחלה ניתן להשיג באמצעות השימוש בטכניקות אלה.
הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטה יעילה ועקבית להעשרת תרבויות לתאים עם תכונות של תאי גזע משורות תאי סרטן השחלות הוקמו וישים לדגימות חולים עיקריות. שיטה זו מעשירה בהצלחה לטיקים על פני מגוון רחב של שורות תאים. היא מאפשרת בזמן זיהוי של תנאים המעשירים לTIC ו / או הפנוטיפ סרטני, מבלי לקחת זמן כדי למיין את הטיקים מהלא-טיקים באוכלוסייה מבחינה פיזית. באופן זה, רמות היחסית של מסלולי איתות שונים ניתן להעריך על תרומתם לפנוטיפ TIC ידי השוואת תרבויות חסיד מסורתיות לTic תרבויות תוך שימוש במגוון של מבחני תפקודיים. אם אוכלוסיית TIC טהורה היא רצויה, בידוד יכול להיות מושגת בקלות על ידי שילוב צעד מיון בסיוע הקרינה או מגנטית בזרימת cytometry פרוטוקול.
חשוב לזכור, עם זאת, כי הביטוי של סמן TICים, כגון CD133, CD44, או ALDH, עשוי להשתנות בין שורות תאים או דגימות חולים אפילו מאותו סוג הגידול. לדוגמא מצאנו כי יש לי OVCAR-5 התאים ביטוי גבוה יותר של CD44 ביחס לCD133, ואילו ההפוך הוא נכון עבור ACI-23. לכן זה רלוונטי להסתמך על התחלה של גידול בעכברים וזרימת cytometry ניתוח כמוחלט של נוכחות TIC. בעקבות פרוטוקול זה, פעילות הגבוהה ALDH נצפתה באופן עקבי כאשר תאי סרטן השחלות גדלו בתנאים בתאי גזע. מעניין, ביטוי CD133 הוא גבוה באופן עקבי בACI-23 תאים שגודלו בתנאי תרבות TIC מסורתיים, ואילו ALDH הוא גבוהה ביותר בתנאי TIC מצוף. בניגוד TGS-3 תאי מיימת העיקריים להציג עלייה קטנה בחיוביות CD133 בתנאי TIC מצוף, אבל גידול מרשים בפעילות ALDH בתנאי TIC מסורתיים. ממצאים אלו מדגישים את ההטרוגניות של תאי סרטן השחלות והפלסטיות נפוצים הקשורים טיקים. כדי לתמוך בCLA נוסףim כי שיטות אלה לשפר את הטיקים, העשרת TRA-1-60 תאים חיוביים נצפתה גם. TRA-1-60 הוא סמן pluripotency ונעשה שימוש כדי לזהות קרצינומה עוברית של השחלה ואשכים, כמו גם סרטן ערמונית TICS 30-32. למרות שהשיטות שלנו היו מוצלחות עם שורות תאים רבות, זה אפשרי, כי תנאי TIC סטנדרטיים עשויים להיות מתאימים יותר לחלק מתאי סרטן השחלות, ואילו תנאי המצוף שונה טובים יותר להעשיר לטיקים באוכלוסיות תאי סרטן השחלות אחרות. זה מדגיש שוב את ההטרוגניות הצפויה בתוך שני שורות תאי סרטן השחלות-המטופל נגזרות והקימו.
בנוסף לסמנים פני תא יש כמה גורמי תעתיק שהוכחו לאפיין טיקים סרטן השחלות כוללים Nanog, Sox2, אוקטובר -4 11, אם כי סמנים אלה אינם ספציפיים לטיקי סרטן השחלות ולא מייצגים גורמים חשובים לpluripotency בתאי גזע העוברי וDIFferentiation 33,34. בחנו את השינויים ברמות חלבון של גורמים אלה ומצאנו כי רמות Nanog להגדיל בתנאי תרבות TIC, בהסכם עם אחרים 13,35 כמו גם CD133, TRA-1-60, וCD117. מערך cDNA סמן תאי גזע אנושי נוסף הראה עלייה בגנים CD133, Nanog, מלק, וPODXL בתנאי TIC בהשוואה לתנאים חסיד מסורתיים. חשוב לציין, יש לציין כי, כעם סמנים פני תא, גורמי תעתיק הקשורים לטיקי השחלות עשויים להשתנות בין שורות תאים ודגימות מטופל.
ראינו כי תאים סרטניים עשויים להיות יותר ולהביע את הרמות גבוהות יותר של סמנים בתאי גזע אם הם מטבעם לא חסיד במבחנה (כלומר, צף תאים שאינם מוכן לצרף לצלחת חסיד). בתרבות, יש לי שורות תאים כגון ACI-23 בדרך כלל רבים תאי קיימא צפים ו / או תאים שגדלים בצורה אנכית באופן לערום תחת קונדיט התרבות המסורתייונים. למרות העשרה מוצלחת של טיקים מהתאים ואגרגטים צף יכולה להיות שורות תאים החלים על מעטים יחסית כולל אלה שבמחקר הנוכחי וOVCAR-3 12, הממצאים שלנו מציעים זה עשוי לייצג אוכלוסיית tumorigenic יותר. לכן, קציר האוכלוסייה "צף" של תאים שגודלו בצלחות תרבית רקמה סטנדרטית ותקשורת יכול לשמש כדרך חלופית להעשרת TIC, לתאים שיתאימו בצורה גרועה לתקשורת בתאי גזע המסחרית.
שימוש בשיטות התרבות השונות שהוצגו בכתב היד הזה יאפשר העשרה מהירה של אוכלוסיות TIC והבנה טובה יותר של גורמים שתומכים בפנוטיפ זה בתאים שונים. יישומים הנוכחיים של שיטה זו כוללים אפיון שמסלולי איתות חיוניים לתמיכה בריבוי של אוכלוסייה ייחודית זו של תאים. תוצאות ממחקרים אלה יסייעו להבהיר את המנגנונים של התקדמות גידול ולהרע.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |